银离子-聚酰胺纱布敷料覆盖促进烧伤感染模型大鼠创面愈合的作用及其机制

马燕，靳媛媛，李灿，黄智勇，王德怀，刘漪沦

1成都市第二人民医院，成都610011；2成都医学院第一附属医院；3成都医学院

烧伤为临床常见病，若不能获得及时有效治疗，易引发局部、全身炎性反应，甚至发生不可控感染和死亡[1]。既往多采用口服抗生素治疗烧伤，但抗生素难以到达创面，常无法有效控制创面感染[2]。研究显示，外敷药物可直接作用于感染创面，能够有效抑制炎性反应、促进皮损修复，并缓解疼痛，有助于患者康复[3]。目前临床上使用的普通纱布敷料多为凡士林，仅能起到掩盖创面的作用，保湿效果不佳，在治疗过程中不能保护创面及创周清洁；聚酰胺纱布敷料比普通纱布有更好的保湿及缓解疼痛的效果，在临床上得到越来越多的应用，但在促进伤口愈合方面的效果还有待提高[4]。银离子-聚酰胺纱布敷料为我院自行研制的新型抗菌敷料，2018年3月～2019年3月，我们通过建立烧伤感染大鼠模型，观察银离子-聚酰胺纱布敷料对大鼠相关血管相关因子、炎性介质及疼痛介质等的影响，评价银离子-聚酰胺纱布敷料治疗烧伤感染创面的效果。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 SPF级SD健康大鼠60只，购自长沙市天勤生物有限公司。屏障环境、正常饮食，适应性饲养1周后用于实验。硝酸银(湖南尔康制药股份有限公司)、聚维酮K-30(哈尔滨乐泰药业有限公司)、柠檬酸三钠(北京奥莱博科技有限公司)，VEGF大鼠单克隆抗体、MMP-2大鼠单克隆抗体、MMP-9大鼠单克隆抗体、β-actin大鼠单克隆抗体(英国Abcam)，BCA Protein Assay Kit(上海碧云天)，PVDF膜(美国Bio-Rad)，免疫组化试剂盒(森贝伽)，HE染色剂、PBS缓冲液(武汉博士德),山羊抗鼠HRP抗体(上海沪峰化工)，化学发光显色试剂盒(美国Thermo Fisher SCIENTIFIC)；鼠β-内啡肽(β-EP)、5-羟色胺(5-HT)、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒(上海AMEKO)。Bio-Rad凝胶成像仪、Motic6.0图像分析系统及Motic显微镜(麦克奥迪)。

1.2 银离子-聚酰胺纱布敷料制备 将400 mg硝酸银加入1 L蒸馏水充分搅拌，依次加入300 mg聚维酮K-30、300 mg柠檬酸三钠，紫光灯照射、磁力搅拌下反应4～5 h，得到银离子复合物混合液。将混合液离心，弃上清，烘干。称取适量的加入去离子水制成240 μg/mL的银离子复合物溶液。取聚酰胺纱布敷料，无菌水冲洗，滤纸吸去表面液体，浸入银离子复合物溶液48 h后取出。经扫描电子显微镜观察，可见聚酰胺纱布敷料表面及内部均有大量银颗粒，覆盖均匀，散在分布。

1.3 混合菌液制备 挑取金黄色葡萄球菌ATCC25923标准菌株、铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853至肉汤培养基，调整细菌密度为1×108CFU/mL。两种菌株各取100 μL置于96孔板，37 ℃孵育7 d。

1.4 动物分组与处理 大鼠腹腔注射0.01 mL/g戊巴比妥钠麻醉，剃去背部单侧毛发，以吸管吸取沸水，将脱去毛发部位烫伤，面积为3 cm×3 cm。烫伤3 d后，于烫伤部位皮下注射混合菌液50 μL。7 d后，按照随机数字表法将成模大鼠分为对照组、Polyamide组、Ag-Polyamide组各20只,分别以普通纱布敷料、聚酰胺纱布敷料、银离子-聚酰胺纱布敷料覆盖感染创面，棉垫绷带适力包扎固定。每3 d换药1次，共治疗15 d。

1.5 创面愈合情况评价 ①创面愈合率：治疗前及治疗15 d后，使用刻度表尺标定创面，测量创面面积，计算创面愈合率，创面愈合率=(治疗前创面面积-治疗15 d创面面积)/治疗前创面面积×100%。②愈合时间：从治疗开始到创面愈合率达80%的时间。③烧伤组织含水量：取创面全层皮肤200 mg，以吸水纸吸干表面水分，称取湿重；烘干，称取干重。含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。④抑菌率：采用烧瓶振荡法[5]检测，抑菌率=(治疗前平均菌落数-治疗后平均菌落数)/治疗前平均菌落数×100%。⑤瘢痕评分：使用VSS量表中文版[6]评价烧伤创面瘢痕增生情况，包括血管分布、瘢痕厚度、色泽及柔软度4个维度，量表总分15分，分值越低说明瘢痕增生程度越轻。

1.6 血清疼痛介质β-EP、5-HT检测 治疗前及治疗15 d分别从尾静脉取血5 mL，EDTA抗凝，4 ℃、3 000 r/min离心20 min，收集上清。使用ELISA试剂盒检测β-EP、5-HT水平。

1.7 创面组织病理学检查 采用免疫组化法。治疗前及治疗15 d后，麻醉大鼠，取创面中央位2 cm×2 cm的正方形组织，一部分冷冻备用，另一部分加入4%甲醛溶液固定48 h，脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡，按照SP试剂盒说明书进行免疫组化染色。自来水冲洗，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。采用Motic显微镜放大10倍观察。

1.8 创面组织中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α检测 取冷冻的创面组织加入PBS匀浆，2 000 r/min离心20 min，取上清。使用ELISA试剂盒检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.9 创面组织中血管相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9表达检测 采用Western blotting法。取冷冻组织加入RIPA裂解液充分匀浆，4 ℃离心15 min，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，加入二抗，室温孵育2 h。采用化学发光显色试剂盒显色，Bio-Rad凝胶成像仪拍照，Motic6.0图像分析系统读取相对值。

2 结果

2.1 三组创面愈合情况比较 见表1。

表1 三组创面愈合情况比较

2.2 三组治疗前后血清β-EP、5-HT水平比较 见表2。

表2 三组治疗前后血清β-EP、5-HT水平比较

2.3 三组创面组织病理变化比较 对照组创面可见毛囊、皮脂腺和深层的肌肉组织尚存，但肌肉组织有明显的变性坏死，创面表皮增生，毛细血管、纤维母细胞继续增生。Polyamide组创面肌肉组织变性坏死较对照组减轻，炎症反应不明显，创面已上皮化。Ag-Polyamide组创面完全上皮化，上皮细胞分化良好。

2.4 三组治疗前后创面组织中VEGF、MMP-2、MMP-9表达比较 见表3。

表3 三组治疗前后创面组织中VEGF、MMP-2、MMP-9表达比较

2.5 三组治疗前后创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较 见表4。

表4 三组治疗前后创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较

3 讨论

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌是常见的皮肤条件致病菌，可分泌大量蛋白酶和毒力因子，妨碍伤口闭合。目前对于烧伤感染临床多采取抗生素治疗，尽管口服抗生素可清除进入机体的细菌，但难以有效清除创面细菌，致使局部反复感染，加重病情。外用敷料直接覆盖于创面，既可有效阻止外界细菌散落于创面，又可使药物接触创面，直接发挥清除细菌、抑制炎性反应、缓解疼痛、促进创面恢复的作用。聚酰胺纱布通透性好，质地柔软，无刺激，有助于创口生长[7]。由于聚酰胺分子的极性酰胺键具有较强的吸水性，因此聚酰胺纱布敷料具有良好的保湿性能，可避免创面与敷料粘连，减少换药疼痛，但在促进伤口愈合方面的效果还有待提高。研究显示，银离子与细菌体内的含巯基蛋白相结合，使其变性、失活，抑制巯基酶参与的各种生命活动；银离子可结合DNA碱基，致使细菌DNA变性，诱导细菌死亡[8，9]。将银与聚酰胺结合制成新型的银离子-聚酰胺纱布敷料，可以减少换药次数，简化换药流程，避免多次换药导致的细菌感染及对创面组织的伤害，缓解患者疼痛，从而促进创面愈合。本研究结果显示，Ag-Polyamide组创面愈合率、烧伤组织含水量、抑菌率均高于对照组和Polyamide组，创面愈合时间、瘢痕评分低于对照组和Polyamide组，表明与普通纱布敷料、聚酰胺纱布敷料相比较，银离子-聚酰胺纱布敷料可促进创面愈合，保持烧伤组织含水量，抑制细菌增殖，促进组织修复，避免瘢痕生成。Ag-Polyamide组创面组织病理变化均优于其他两组，表明银离子-聚酰胺纱布敷料更有助于烧伤组织修复。

β-EP为内源性阿片肽，当外周组织损伤或发生炎性反应时，该部位的白细胞可分泌大量β-EP，且其水平与组织损伤及炎性反应程度呈正相关。5-HT可作用于肾上腺素β受体，诱导其生成前列腺素，促进胺类物质生成并作用于交感神经引发疼痛[10]。本研究结果显示，治疗后Ag-Polyamide组β-EP、5-HT水平低于Polyamide组、对照组，提示银离子-聚酰胺纱布敷料可有效抑制疼痛介质生成，缓解疼痛。

VEGF为促血管生成因子，可提高血管通透性，促进形成细胞外基质，加速内皮细胞移行，促进新生血管形成[11]。MMP-2、MMP-9为蛋白水解酶，可促进细胞外基质及基底膜降解，破坏基质与组织细胞间的联系，促进炎性细胞浸润，进一步破坏组织[12]。本研究结果显示，治疗15 d后，Ag-Polyamide组VEGF表达水平高于对照组、Polyamide组，MMP-2、MMP-9表达水平低于其他两组，提示银离子-聚酰胺纱布敷料可促进烧伤组织生成VEGF，抑制MMP-2、MMP-9表达，进而促进新生血管形成，具有促进感染创面修复的作用。

IL-6是介导急性炎性反应的重要介质，可抑制多种炎性介质生成，在烧伤修复中具有抗炎的作用，其水平快速升高说明机体处于较强的炎性反应状态[13];IL-1β可诱导间质细胞生成蛋白分解酶，促进创面组织蛋白分解，抑制创面修复[14];TNF-α水平与机体炎性反应程度呈正相关，是评价烧伤感染程度和创面预后评估的重要标志物[15]。本研究结果显示，治疗后Ag-Polyamide组IL-6、IL-1β、TNF-α水平低于对照组、Polyamide组，表明银离子-聚酰胺纱布敷料可有效抑制炎性介质生成。

综上所述，银离子-聚酰胺纱布敷料可有效抑制烧伤感染模型大鼠创面细菌，减少炎性介质、疼痛介质生成，缓解疼痛，刺激生成VEGF，促进创面恢复，提高创面愈合率。