miR-148a靶向Wnt1通路对结直肠癌细胞侵袭、迁移能力的影响

蒋学军，杨勇，庹磊，吉祖进，雷新益

湖北省十堰市国药东风总医院，湖北十堰442001

结直肠癌(CRC)是临床常见的恶性肿瘤之一，具有发病隐匿、恶变时间长的特点，发病率和病死率逐年升高[1]。Wnt1可调控细胞生长、分化、迁移，是结肠癌发生发展的经典调控分子[2]。N-钙黏蛋白(N-cadherin)可介导细胞与细胞间的动态黏附，其高表达可导致大量癌基因作用增强，并促进肿瘤的浸润和转移[3]。基质金属蛋白酶2(MMP-2)可降解细胞外基质(ECM)，促进癌细胞向前移行[4]。有研究发现，长链和短链非编码RNA可调控Wnt1分泌并参与调控经典的Wnt通路促进CRC细胞的增殖和迁移[5，6]。微小RNA-148a(miR-148a)属于短链非编码RNA，参与肿瘤发生发展过程，与CRC预后不良密切相关[7]。2019年3～11月，我们观察了miR-148a对CRC细胞侵袭、迁移能力的影响，并探讨其与Wnt1通路的关系，旨在为临床治疗CRC提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人正常结直肠黏膜细胞FHC购自上海冠导生物工程有限公司，人CRC细胞HCT116购自上海博湖生物科技有限公司，人CRC细胞SW620购自上海冠导生物工程有限公司。miR-148a激动剂(miR-148a mimic)及阴性对照(miR-148a NC)均购自无锡莱弗思生物实验器材有限公司，Lipo2000转染试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司，DMEM高糖和RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司，N-cadherin、MMP-2、β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt1抗体购自美国Santa Cruz公司。Transwell小室(美国BD公司)，全自动酶标仪(美国Versamax公司)，实时荧光定量PCR仪(德国QIAGEN Rotor-Gene Q)。

1.2 细胞培养 将FHC、HCT116、SW620细胞快速解冻，离心收集细胞，按1×105/孔接种于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，常规传代、计数。

1.3 细胞miR-148a、Wnt1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。取对数生长期FHC、HCT116、SW620细胞，加入胰酶消化，离心，收集细胞，用TRIzol试剂盒抽提总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA。按试剂盒说明建立反应体系及参数，进行扩增。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：miR-148a上游5′-CTCGGCAGTCAGGCGT-3′，下游5′-GTCTCCGTCGCTTTCAGACGAT-3′；Wnt1上游5′-TGCTGTCCCTGTGGTATTGT-3′，下游5′-ACAGCTTTCCTTGCCCTTTC-3′；U6上游5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′；GAPDH上游5′-AGTCAGGTATCCCACAGGAAACAG-3′，下游5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′。反应条件：95 ℃预热3 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共36个循环；72 ℃ 5 min终止反应。分别以U6、GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-148a、Wnt1 mRNA的相对表达量，实验重复3次。

1.4 转染miR-148a激动剂对HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响分析

1.4.1 细胞分组与转染 收集对数生长期HCT116细胞，按1×105/孔接种于6孔板，加入完全培养基，培养箱中培养过夜，更换为无血清培养基继续培养2 h。将细胞分为Control组、miR-148a mimic组、miR-148a NC组。miR-148a mimic组、miR-148a NC组分别加入miR-148a mimic液、miR-148a NC液与Lipo2000转染液的混合物，用不含胎牛血清的培养基培养48 h，Control组不做任何处理。收集各组细胞，进行后续试验。

1.4.2 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。收集三组细胞，加入胰酶消化，离心，收集细胞，用不含胎牛血清的培养基重悬，调整细胞密度为5×105/mL。预先用不含胎牛血清的培养基按1∶8稀释Matrigel基质胶，包被每个小室基底膜，置于恒温箱中2 h。待基质胶凝固后，取细胞悬液200 μL加入小室，置于恒温箱中培养过夜。取出小室，PBS冲洗，用棉签擦去小室内侧的细胞，加入4%多聚甲醛溶液固定，结晶紫染色。高倍显微镜下拍照，随机取5个视野计数穿膜细胞数。实验重复3次。

1.4.3 细胞迁移能力观察 除Transwell小室不包被Matrigel基质胶外，其余操作同“1.4.2”。

1.4.4 细胞miR-148a、Wnt1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。收集三组细胞，加入胰酶消化，离心，收集细胞。按照“1.3”步骤检测miR-148a、Wnt1 mRNA的相对表达量。

1.4.5 细胞Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集三组细胞，加入RIPA裂解液进行裂解后提取总蛋白，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。取50 μg蛋白进行电泳、PVDF转膜，用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h。加入相应的一抗(Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2稀释倍数均为1∶1 000，GAPDH稀释浓度为1∶2 000)，4 ℃孵育24 h。洗涤后，加入HRP标记的二抗(羊抗兔IgG)，室温孵育1 h。洗涤，采用增强化学发光法显色，凝胶成像仪观察条带并拍照，Image J软件分析各组蛋白的相对表达量。

1.5 miR-148a与Wnt1的靶向关系验证 采用双荧光素酶法。合成Wnt1的3′ 非翻译区(3′ UTR)的miR-148a识别序列，克隆至pmiRGlo载体，得到pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-WT。另外对miR-148a识别区Wnt1碱基进行突变连接至pmiRGlo载体，得到pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-MUT。分别将pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-WT、pmiRGlo-Wnt1-3′ UTR-MUT质粒与miR-148a NC、miR-148a mimic共转染，分为miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-WT组、miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-WT组、miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-MUT组、miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-MUT组，按照转染试剂盒说明书进行转染。转染24 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，添加萤火虫和海参荧光素酶试剂上机检测。每孔的数值以萤火虫荧光活性/海参荧光活性显示。

2 结果

2.1 FHC、HCT116、SW620细胞中miR-148a、Wnt1 mRNA表达水平比较 与FHC细胞相比，HCT116、SW620细胞miR-148a表达水平降低(P均<0.05)，Wnt1 mRNA表达水平升高(P均<0.05)；HCT116细胞与SW620细胞相比，miR-148a、Wnt1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 FHC、HCT116、SW620细胞中miR-148a、Wnt1 mRNA表达水平比较

2.2 转染miR-148a激动剂对HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响

2.2.1 三组细胞侵袭、迁移能力比较 与Control组和miR-148a NC组相比，miR-148a mimic组细胞侵袭和迁移实验的穿膜细胞数均明显较少(P均<0.05)，Control组与miR-148a NC组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 三组细胞侵袭、迁移实验的穿膜细胞数比较(个

2.2.2 三组miR-148a、Wnt1 mRNA表达比较 与Control组和miR-148a NC组相比，miR-148a mimic组Wnt1 mRNA表达水平降低(P均<0.05)，miR-148a表达水平升高(P均<0.05)；Control组与miR-148a NC组相比差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 三组miR-148a、Wnt1 mRNA表达比较

2.2.3 三组Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2蛋白表达比较 与Control组和miR-148a NC组相比，miR-148a mimic组HCT116细胞中Wnt1、β-catenin、MMP-2、N-cadherin蛋白表达均降低(P均<0.05)；Control与miR-148a NC组相比差异无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 三组Wnt1、β-catenin、N-cadherin、MMP-2蛋白表达比较

2.3 miR-148a与Wnt1的靶向关系 miRtarbase预测显示，miR-148a与Wnt1 mRNA的3′UTR有结合位点，见表5。双荧光素酶报告基因检测显示，与miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-WT组比较，miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-WT组荧光素酶活性降低(P<0.05)；miR-148a NC+Wnt1-3′ UTR-MUT组、miR-148a mimic+Wnt1-3′ UTR-MUT组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表5 miRtarbase预测miR-148a与Wnt1 mRNA靶向关系

表6 各组基因荧光素酶相对活性比较

3 讨论

CRC的发病率和病死率占消化道恶性肿瘤的首位。CRC进展的关键步骤是肿瘤细胞的侵袭、迁移，肿瘤细胞扩散到邻近组织并在附近组织中定殖、生长，最终导致患者死亡[8]。目前研究认为，CRC的发生发展与癌基因和肿瘤抑制基因表达失调、表观遗传学突变等因素有关，但其确切机制目前尚不明确[9]。新型调控分子miRNA可调控癌基因和肿瘤抑制基因表达，并参与CRC发生发展过程[10，11]。

研究表明，miR-148a参与了肿瘤的发生发展过程，但其作为抑癌基因还是癌基因，目前仍存在争议。Li等[12]报道，miR-148a可促进胶质母瘤细胞增殖、侵袭；Zhao、Dybos等[13,14]报道，miR-148a可促进骨肉瘤和前列腺癌增殖，推测miR-148a为癌基因。而Han、Liu等[15,16]报道，miR-148a过表达可抑制癌细胞侵袭，推测miR-148a为抑癌基因。关于miR-148a在CRC中的研究报道较少，Takahashi等[7]发现，miR-148a在CRC患者中低表达，可作为CRC患者晚期预测指标。本研究结果显示，与正常结直肠FHC细胞相比，人CRC细胞HCT116、SW620中miR-148a表达显著降低，表明miR-148a可能作为抑癌基因参与CRC的发生发展。

N-cadherin、MMP-2蛋白与肿瘤侵袭和迁移关系密切。N-cadherin是一种新型的肿瘤预后标志物，可促进CRC侵袭和迁移，加速其恶性进展进程[17]；CRC的侵袭和迁移是导致患者死亡的主要原因，而CRC的侵袭和迁移需要通过激活MMP-2的表达来实现[18]。研究表明，Wnt通路可促进CRC细胞的增殖和迁移。Cheng等[19]报道，激活Wnt/β-catenin通路可促进CRC细胞增殖。郭丽等[20]报道，抑制Wnt1/β-catenin通路激活后，胃癌细胞中侵袭迁徙相关基因N-cadherin、MMP-2 mRNA及蛋白表达均降低，提示Wnt1/β-catenin通路激活可能与肿瘤侵袭、迁移能力增强有密切关系。Wang等[21]报道，抑制CRC肿瘤组织中Wnt1分泌，可抑制CRC患者肿瘤进程。本研究发现，与正常结直肠FHC细胞相比，人CRC细胞HCT116、SW620中Wnt1 mRNA表达显著增高，表明Wnt1在CRC中处于激活状态，与上述文献研究一致。但miR-148a是否通过Wnt1通路调节CRC细胞迁移、侵袭未见报道。本研究通过建立HCT116细胞miR-148a过表达体系发现，与Control组和miR-148a NC组相比，miR-148a mimic组HCT116细胞中miR-148a表达增高，Wnt1通路相关Wnt1及β-catenin蛋白表达降低，而细胞侵袭、迁移相关蛋白MMP-2、N-cadherin蛋白表达也明显降低，表明miR-148a mimic可抑制Wnt1/β-catenin通路激活，抑制CRC细胞侵袭、迁移。进一步通过双荧光素酶报告试验发现，miR-148a与Wnt1 mRNA存在直接靶向关系，推测miR-148a可能通过靶向抑制Wnt1通路蛋白表达，抑制CRC细胞侵袭、迁移。

综上所述，miR-148a可能通过靶向抑制Wnt1通路蛋白表达，抑制CRC细胞侵袭、迁移。为临床治疗CRC提供一定的参考。但肿瘤细胞侵袭、迁移等恶性肿瘤生物学过程中分子生物学机制复杂，可能有多个miRNA靶向作用于Wnt1通路，具体机制还有待进一步探讨。