产β-葡萄糖醛酸苷酶菌株胃肠道耐受性与酶学特性研究

2020-09-27孔利华高书锋王升平周映华曾发姣周小玲邬理洋刘惠知

家畜生态学报 2020年9期

孔利华，高书锋，雷平，王升平，周映华，龚平，曾发姣，缪东，周小玲，曾奥，舒燕，邬理洋，刘惠知

(湖南省微生物研究院，湖南长沙 410009)

随着畜禽养殖规模化、集约化发展，抗生素在饲料中长期添加使用，造成畜禽肠道菌群失衡、内源性及二重感染和药物残留等弊端[1-2]，迫切需要一种新的替代品，中草药和微生态制剂在畜禽养殖业中的应用，已成为国内外学者研究的热点[3-4]，也是未来绿色饲料发展的重要方向之一。

黄芩主要成分为黄芩苷，其次为黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，具有多种药理活性，包括抗炎[5-7]、抗氧化[8]、抗微生物[7-9]、抗病毒[10-11]、清除自由基[7,12]等。黄芩苷需经动物肠道菌群作用水解成黄芩素后，才能被吸收和发挥药效[13]，黄芩素各方面药理作用均强于黄芩苷[14]。黄芩中黄芩素含量约1%，黄芩苷含量大于10%，β-葡萄糖醛酸苷酶可水解黄芩苷为黄芩素[15]，对提高药理活性具有重要意义。

目前，黄芩素大多从药材直接提取，近年来已有一些文献报道利用侧耳菌[14]、黑曲霉[16-17]、米曲霉[18]、青霉菌[19-20]、纳豆芽孢杆菌[21]、短乳杆菌[22]、蓝藻[23]对黄芩进行生物转化，但所用微生物转化菌株多为真菌类，难免会产生安全性问题，蓝藻爆发存在生态污染隐患，而作为益生菌的纳豆芽孢杆菌，却非肠道固有土著菌种，在动物肠道中能否定殖、发挥益生作用还不明确。本试验从健康鸡小肠内容物中筛选出一株产β-葡萄糖醛酸苷酶的JY24菌株，并对该菌株分类特征、胃肠道环境耐受性和β-葡萄糖醛酸苷酶酶学特性进行了初步研究，为进一步发酵转化黄芩苷生产活性产物黄芩素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基 LB培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2，琼脂20 g(固态)；筛选培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，黄芩苷0.5 g，蒸馏水1 000 mL， pH 7.0～7.2，琼脂20 g；发酵培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、磷酸二氢钾1.0 g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要试剂黄芩素(ANPEL Laboratory Technologies,98.7%)、黄芩苷(上海瑞永生物科技有限公司，≥98.0%)、对硝基苯酚(Dr.Ehrenstorfer GmbH，Germany，99.4%)、对硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷(Sigma Aldrich，美国，>99%)、硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工有限公司)、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒Sk8225、PCR产物胶回收试剂盒(购自生工)，pMD@-18T Vecter连接试剂盒(购自Takara公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离、筛选

1.2.1.1 菌株分离纯化健康鸡只宰杀后，立刻从小肠内容物中取样1.0 g，置于装有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，无菌水进行梯度稀释，选择10-3、10-4、10-5和10-64个稀释度，取0.1 mL稀释液涂布于筛选平板，35 ℃培养24 h，对生长菌株进行划线纯化，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.1.2 菌株筛选将分离菌株活化后，取3环至LB培养液，35 ℃、200 rpm培养48 h，培养液于10 000 rpm、4 ℃冷冻离心10 mins，上清液经0.2 μm微孔滤膜过滤，得粗酶液。将粗酶液点样于筛选培养基平板，置40 ℃培养箱24 h，喷2%FeCl3乙醇溶液显色，30 min后观察平板显色圈有无、颜色和大小[24]，以显色圏直径大小衡量菌株产酶能力大小。

1.2.1.3 菌株复筛(薄层层析检测) 发酵滤液制备：初筛菌株活化后，取3环至LB培养液，35 ℃、200 rpm培养20 h，再取3 mL种子液至含1%黄芩苷标准品的发酵培养液中，35 ℃、200 rpm培养48 h，培养液经10 000 rpm、4 ℃冷冻离心10 min，上清液经0.2 μm微孔滤膜过滤，待用。黄芩苷、黄芩素标准品溶液配制及薄层层析检测按中药成分分析[25]方法进行。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 形态特征观察菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色镜检。

1.2.2.2 生理生化特征参阅常见细菌鉴定手册[26]、伯杰氏细菌鉴定手册[7]进行。

1.2.2.3 16S rDNA序列分析提取JY24菌株基因组总DNA，采用16S rDNA通用引物进行扩增，PrimerA正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，PrimerB反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，通用引物由上海生工合成。PCR 产物1.0%琼脂糖凝胶电泳，SK8131胶回收试剂盒纯化回收，上海生工进行序列测序。l6S rDNA基因序列在Genbank核酸数据库中进行Blast比对和同源性比较，将与之同源性最高的15株模式菌株的16S rDNA序列，采用MegAlign软件进行同源性分析，构建系统发育树。

1.2.3 JY24菌株胃肠道环境耐受性试验

1.2.3.1 人工胃液、肠液耐受性试验按1%接种量将JY24菌株发酵液分别接入人工胃液(pH2.5)和肠液[28]中，37 ℃、200 rpm 摇床培养，于0、0.5、1.5和3 h时分别取样1 mL，无菌水梯度稀释，10-5梯度中取1 mL稀释液，倾注法平板计数(平行3次)，35 ℃培养48 h，观察记录活菌数量。

1.2.3.2 胆盐耐受性试验按1%接种量将JY24菌株发酵液接入猪胆盐浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.30、0.50和1.0%LB培养液，37 ℃、200 rpm 培养12 h，分别取样1 mL，无菌水梯度稀释，10-5梯度取1 mL稀释液，倾注法平板计数(平行3次)，35 ℃培养48 h，观察记录活菌数量，考察菌株耐受胆盐能力[29]。

1.2.4 酶学特性研究

1.2.4.1 温度对酶活性影响各取粗酶液2 mL，将酶反应温度分别设为20、25、30、35、40、45、50、55、60和65 ℃，测定各处理酶活性[30-31]，确定最适温度。各取粗酶液2 mL，分别置于40、50和60 ℃水浴恒温处理不同时间，于0、10、20、30、40、50和60 min时取样测定酶活性，考察该酶对温度耐受性。

1.2.4.2 pH对酶活性影响各取粗酶液10 mL，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将粗酶液pH分别调为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，测定各处理酶活性，确定最适pH。各取粗酶液10 mL，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将粗酶液pH分别调为5.5、6.5、7.0和7.5处理一定时间，分别于0、10、20、30、40、50和60 min时取样测定酶活性，考察该酶对pH耐受性。

1.2.4.3 金属离子对酶活性影响各取粗酶液10 mL，分别加入KNO3、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeCl3、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O 和无菌水(对照)，使金属离子浓度达2.5 mmol/L，35 ℃保温1 h，取样，在酶最适温度和pH下测定各处理酶活性，分析金属离子对酶活性影响。

2 结果与分析

2.1 菌株分离筛选

2.1.1 菌株分离、初筛共计采集健康鸡小肠内容物37批次，经分离纯化，获得223株鸡源肠道菌株，经进一步初筛，获得4株产β-葡萄糖醛酸苷酶菌株，菌株编号：JY15、JY24、JY100和JY120，其中JY24菌株显色圈直径最大，平均直径16.8 mm，表明该菌株具有较高产β-葡萄糖醛酸苷酶能力，初筛结果见图1。初筛平板中黄芩苷，经产酶菌株水解为黄芩素，喷以2%FeCl3乙醇溶液显色，点样处周围出现显色圈，平板背景为未被水解黄芩苷，显绿色，点样处为水解生成黄芩素，显棕黑色。

2.1.2 菌株复筛(薄层层析检测) 发酵滤液、黄芩苷及黄芩素对照品溶液，经点样、展开、晾干和显色，结果见图2，发酵滤液(点样1)在与黄芩苷标准品(点样2)色谱相应高度位置上，显一相同暗绿色斑点，在与黄芩素标准品(点样3)色谱相应高度位置上，显一相同黑色斑点，发酵滤液有黄芩素生成，表明JY24菌株在发酵过程中，产生了β-葡萄糖醛酸苷酶，进而水解底物黄芩苷，生成产物黄芩素。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态特征 LB培养基生长良好，48 h形成直径5 mm左右圆形菌落，淡黄色，表面皱褶，边缘整齐，湿润，不透明。革兰氏染色阳性，菌体杆状，单个或成链排列，形成芽孢。

2.2.2 生理生化特征菌株生理生化特征见表1。

表1 JY24菌株生理生化特征Table 1 The physiological and biochemical characteristics of strain JY24

2.2.3 16SrDNA序列分析以JY24菌株基因组DNA为模板，细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，获特异性较高唯一产物，大小1 500 bp左右，经克隆、测序和序列分析，所获DNA片段长度1 491 bp，与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SSL2(序列登录号：MH192382.1)等枯草芽孢杆菌菌株存在99%～100%同源性，结合该菌株形态、生理生化特征，确定JY24菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌株在GenBank序列登录号为MK796126。

2.2.4 系统发育树构建将JY24菌株16S rDNA序列递交GenBank，blast同源性搜索，运用DNAStar软件，将所测序列及GenBank中收录的与之同源性最高的15株菌株的16S rDNA序列进行同源性分析，构建系统发育树，结果如图3。结果表明：JY24菌株与15株枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性为99%～100%。

2.3 JY24菌株耐受性试验

2.3.1 人工胃液、人工肠液耐受性试验 JY24菌株在人工胃液、肠液中耐受性结果见图4。在人工胃液中存活率下降较快，0.5、1.5和3.0 h存活率分别为89.33%、58.67%和36.00%，人工肠液中下降较慢，0.5、1.5和3.0 h存活率分别为96.33%、88.07%和81.65%，表明该菌株对人工胃液、肠液均有一定耐受性。

2.3.2 耐胆酸盐试验耐胆酸盐试验结果表明：胆盐浓度在0.01%～1.0%浓度范围时，随胆盐浓度逐渐升高，JY24菌株耐受能力呈下降趋势，其中，最高耐受胆盐浓度为0.3%～0.5%。胆盐浓度小于0.3%时，JY24菌株生长良好，未受到抑制；胆盐浓度为0.3%～0.5%时，菌株生长较好，受到一定程度抑制；胆盐浓度在0.5%～1.0%时，菌株生长极差，基本受到完全抑制。

2.4 酶学特性初步研究

2.4.1 温度对酶活性的影响由图5可知，温度为20～65 ℃时，JY24菌株所产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活先快速升高而后逐渐下降，当温度为35 ℃时，酶活最大为35.04 U/mL，确定该酶最适温度35 ℃。由图6可知，JY24菌株所产β-葡萄糖醛酸苷酶在40 ℃下酶活相对稳定，随保温时间延长下降不明显，50 ℃下随保温时间延长下降较快，60 ℃下随保温时间延长快速下降。40、50和60 ℃处理10 min相对酶活分别为96.43%、87.76%和67.37%，处理1 h相对酶活分别为72.96%、31.63%和0。

2.4.2 pH对酶活性的影响 pH对酶活性的影响见图7。由图7可知，在pH为3.5～8.0之间，JY24菌株所产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活先逐渐升高后快速下降，pH>7.0时，酶活下降较快，表明该酶对碱耐受性较弱，pH为6.5时，酶活最大为26.64 U/mL，确定该酶最适pH为6.5。pH对酶活稳定性的影响见图8。由图8可知，在pH为6.0或7.0环境下，酶活较稳定，处理1 h相对酶活分别为73.54%和73.63%。pH为5.5和7.5时，随处理时间延长，酶活下降相对较快，处理1 h相对酶活分别为54.54%和57.25%。

2.4.3 金属离子对酶活性的影响金属离子对酶活性的影响见图9。由图9可知，浓度为2.5 mmol/L的Ca2+、Fe3+和Zn2+可使酶活升高11.48%～21.05%，对该酶有激活作用；Fe2+和Cu2+可使酶活性下降15.84%～18.28%，对酶活有抑制作用；K+、Na+、Mg2+和Mn2+对酶活无明显影响。

3 讨论

益生菌是一种定殖于动物肠道起调整肠道微生态平衡的活菌制剂，在进入肠道环境前要经历约2 h低pH(2.0～3.0)胃酸环境、十二指肠高浓度(0.03%～0.30%)胆盐环境和小肠液多种消化酶的降解作用，益生菌须有良好的耐酸能力、经受小肠液胆盐环境和酶降解作用，才能到达肠道发挥益生作用[32-33]。大部分细菌在低pH或者疏水作用下膜蛋白被解离，细菌细胞膜遭到破坏而死亡。研究结果表明，JY24菌株在人工胃液和人工肠液中处理3.0h存活率分别为36.00%和81.65%，最高耐受胆盐浓度为0.3%～0.5%，该菌株对人工胃液、肠液和胆盐均有一定耐受性，并进一步验证了鸡源肠道菌株对胃肠道环境具有天然的耐受性。

β-葡萄糖醛酸苷酶是一种糖苷类水解酶，催化各种类型β-葡萄糖醛酸苷水解产生多种衍生物，并释放出β-葡萄糖醛酸和相应配基[15]。杨光等[34]研究了大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶活力的影响因素，结果表明：最适pH为7.0，Ca2+在0.5～10 mmol/L浓度范围内对该酶具有激活作用，与本研究结果基本一致，该酶活55 ℃比37 ℃高近4.1倍，与本研究该酶最适温度差异明显。冯波等[35]研究表明，牛肝β-葡萄糖醛酸苷酶最适pH5.5，低于本研究最适pH6.5，该酶对温度敏感，30～40 ℃酶活力较高，超过50 ℃后 ,酶活力迅速下降，与本研究一致。刘伶文等[13]报道β-葡萄糖醛酸苷酶最适温度55 ℃，最适pH为6.0，金属离子 Ca2+、Mg2+和Cu2+促进酶促反应，而Fe2+则具有抑制作用，Zn2+在低浓度下起促进作用，高浓度时起抑制作用，与本研究存在一定的出入。分析以上研究表明：不同来源的β-葡萄糖醛酸苷酶具有不同的最适pH和温度，最适pH范围为5.0～7.0，最适温度范围为30～55 ℃，其差异可能与产酶菌株栖息环境和环境中底物种类、浓度有关，金属离子对β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的影响存在差异，可能与不同酶解体系差异及金属离子的添加浓度有关。

枯草芽孢杆菌无致病性，对人畜无害，环境兼容性好，被认为是安全的工农业生产菌株，在绿色生态健康养殖领域具有较好的应用前景，广泛应用于饲料添加剂、食品酶制剂等的发酵和生产环节[31]。试验从鸡小肠内容物中筛选出一株产β-葡萄糖醛酸苷酶的JY24菌株，能够耐受胃肠道环境，具有天然的定殖优势和较好的产β-葡萄糖醛酸苷酶能力，是一株潜在的理想益生菌菌株，但还需对发酵条件、酶解工艺进行研究和优化，为发酵转化黄芩苷生产黄芩素、研发益生菌和黄芩素协同联用绿色混合型饲料添加剂产品奠定基础。