猪粪中四环素类抗生素降解菌的筛选及其在堆肥中的应用研究

赵晨光,陈路鹏,黄祚建,王 军,蔡 珣,任竹青*

(1.华中农业大学 动物科技学院/动物医学院，湖北 武汉 430070；2.十堰市畜牧技术推广站，湖北 十堰 442000；3.湖北省畜牧兽医局，湖北 武汉 430064)

随着畜牧业的发展，抗生素作为治疗性药品和非治疗性添加剂在饲料中广泛使用。我国每年兽用抗生素占到抗生素年产量的一半以上，其中四环素类抗生素以其优良的促生长效果、低廉的价格占到兽用抗生素的57%左右[1]。大量残留在猪粪中的四环素类抗生素会进入自然界造成污染并且通过生物链循环富集到人体中[2]。堆肥是在有氧条件下通过微生物作用将粪便资源化、无害化处理的过程，且因其经济、有效等优点成为国内外畜禽粪便资源化利用和无害化处理的主要方式[3]。研究表明，经50 d堆肥后，四环素、土霉素、金霉素的去除率分别为70%、92%、74%[4]。但是堆肥过程中自然微生物菌群具有不固定性，而加入筛选的高效降解菌来提高畜禽粪便堆肥中抗生素降解效果被认为是一种高效、低成本的无害化处理方法[5]。目前国内外关于抗生素降解菌的研究已广泛展开。沈东升等[6]将其实验室筛选的土霉素降解菌(Staphylococcus sp.TJ-1)接种于堆肥中，发现TJ-1的接种可使得土霉素降解率提高20%。沈颖等[7]证明了放线菌、真菌、细菌都可以有效降解抗生素，且不同菌的最适温度不同。成洁等[8]研究证明四环素类降解菌TJ-2#对土霉素、四环素和金霉素3种四环素类抗生素的降解率分别为58.3%、63.9%和65.5%，且TJ-2#能以四环素类抗生素作为唯一碳源。勾长龙等[9]研究发现，高温堆肥对猪粪中低浓度抗生素的去除效果高于对照组。低剂量组的去除率均高于90%，而高剂量组的去除率则在60%～70%。目前国内关于抗生素降解菌的研究主要在菌株筛选与鉴定以及优化去除效果等方面，关于外源添加降解菌对猪粪堆肥中不同浓度的抗生素去除效果的研究鲜有报道。因此，本研究旨在从猪粪中筛选四环素类抗生素降解菌，并研究堆肥过程中外源添加降解菌对猪粪中不同浓度抗生素的去除效果，以期为猪粪中抗生素残留问题提供解决思路。

1 材料与方法

1.1 样品来源

本次试验猪粪样品取自华中农业大学实验猪场及天门、荆门等地猪场。

1.2 培养基

LB液体培养基：酵母浸出物5 g，NaCI 5 g，胰蛋白胨10 g，加双蒸水至1 000 mL，加盐酸或NaOH调pH至7.0 ± 0.05，高温灭菌，4 ℃保存备用。LB固体培养基：酵母浸出物5 g，NaCI 5 g，胰蛋白胨10 g，琼脂粉12～18 g，加双蒸水至1 000 mL，加盐酸或NaOH调pH至7.0±0.05，高温灭菌，待温度降到60 ℃，加入抗生素，混匀后倒入灭菌干燥的培养皿中，超净台内无菌凝固后封口膜封口，标注日期，4 ℃保存备用。

1.3 四环素类抗生素高效降解菌的分离鉴定

取新鲜猪粪样品5 g于50 mL离心管中，向其中加入无菌的生理盐水至50 mL，摇床37 ℃、200 rpm震荡2 h，吸取上清液5 mL接种于含有四环素、金霉素、土霉素20 mg/kg的LB培养基中，43 ℃培养24 h，每次接种，抗生素浓度提高20 mg/kg，接种多次后提高抗生素浓度至200 mg/kg。

将培养至200 mg/kg的培养基重新接种于200 mg/kg抗生素的培养基中，培养8 h后，将培养基稀释至10-6～10-7，吸取50～100 μL均匀涂布于200 mg/kg抗生素的LB固体培养基上。43 ℃培养24 h，观察菌落特征，挑选出形态不同的细菌，分别接种于200 mg/kg抗生素培养基中，培养8 h后，提取菌种DNA扩增后测序，鉴定菌属。

1.4 培养基中抗生素降解试验

称量胰蛋白胨20 g、酵母提取物10 g、氯化钠10 g加水至2 000 mL，NaOH调节pH至8±0.05，120 ℃高压灭菌20 min。待温度冷却后向其中加入四环素、金霉素、土霉素各0.1 g，制成100 mg/kg的抗生素培养基。将降解菌复苏，吸取100 μL降解菌接种于5 mL培养基中，于37℃摇床200 rpm条件下培养12 h至稳定期。吸取稳定期的培养基100 μL，接种于50 mL含抗生素100 mg/kg的LB培养基中，置于摇床43 ℃ ，200 rpm条件下培养，此为试验组。对照组于相同条件下接种等量的无菌培养基溶液。分别取0.5、1、1.5、2、3、4、5 d，7个时间点的培养基样品-40 ℃避光保存。检测样品中抗生素残留量，评估降解菌的降解效果。

1.5 堆肥抗生素降解试验

堆肥试验装置主要由6个高280 mm、长540 mm、宽400 mm，容积60 L，厚度3 mm的泡沫箱组成，以保持堆体温度，装置底部留有小孔，供空气从底部进入。底部铺3 cm左右的锯末作为缓冲层，保证通气量均匀。上层留有直径2 cm的小孔作为出风口。每个堆肥装置中加入体积为60 L，质量为20 kg的混合物。

本次试验在抗生素浓度分别为20 mg/kg(低浓度)和40 mg/kg(高浓度)下，处理组按1∶1000重量比接入降解菌剂，对照组添加等量的无菌培养基。将猪粪与锯末以质量比10∶1混合，调节C/N为20，加水调剂水分至65%左右，调整各组的抗生素浓度为20 mg/kg或40 mg/kg。降解菌剂由驯化筛选的菌株库特氏菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、变形杆菌以体积比1∶1∶1∶1制成(四种细菌菌液浓度为105～108cfu/mL)。对照组和处理组各重复3次。分别测定7 d和14 d抗生素浓度[10]。

堆肥前期每2 d取样一次、堆肥后期每5 d取样一次，每天测量堆体中心的温度。堆体上、中、下三个部分多点取样，样品用保鲜袋封好，4 ℃保存。部分样品风干后粉碎，密封、避光保存用于检测。

1.6 革兰氏染色

对细菌进行涂片、干燥、固定、染色等操作后制成标本切片，等切片自然风干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在盖玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色。

1.7 分析测定方法

堆体中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定采用高效液相色谱法，具体操作技术流程方法参考GB/TB/T32951-2016，C、N含量通过元素分析仪测定，温度使用酒精温度计测定。

1.8 样品的保存

将灭菌后的生理盐水与甘油以体积比3∶2混合，震荡使其充分混合均匀，此为甘油-生理盐水保存液。将细菌接种于新鲜的LB培养基，培养10 h至稳定期。将稳定期的培养基与甘油-生理盐水保存液以体积比1∶1混合于1.5 mL离心管中，涡旋振荡20 s使其充分混合均匀，-80 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 降解菌的分离鉴定

2.1.1 降解菌的分离、纯化 经抗生素培养基培养、分离、纯化后共得到8株细菌，其中4株细菌对于猪粪中四环素类抗生素具有较好的降解效果且无致病性，具备在实际生产中应用的潜力(DOTC14-JM、DTC7-JM、DOTC2-TM、DOTCH-TM)。

在正常光线条件下观察4种菌的生长形态，可以明显看出DOTC14-JM，DOTC2-TM， DTC7-JM为白色菌落，其菌落较小，呈规则的半球形，而DOTCH-TM菌落呈黄色(图1)。经革兰氏染色，判断为革兰氏阳性菌，细菌的生物形态为短杆菌和球菌。

2.1.2 降解菌的16S rDNA序列分析 将4种降解菌的16SrDNA提交至NCBI数据库进行比对分析并构建系统发育树。DOTC14-JM与细菌Enterococcus gallinarum的16SrDNA序列同源性为99%；DTC7-JM与细菌Enterococcus faecium的16SrDNA同源性为99%；DOTC2-TM与细菌Enterococcus faecalis的16SrDNA同源性为99%；DOTCH-TM与细菌Kurthia gibsonii的16SrDNA同源性为99%(图2)。综合判定菌株DOTC14-JM为鹑鸡肠球菌、菌株DTC7-JM为屎肠球菌、菌株DOTC2-TM为粪肠球菌、菌株DOTCH-TM为库特氏菌。

2.2 培养基中抗生素降解效果的检测

2.2.1 3种抗生素的标准曲线 在监测体系中土霉素、四环素和金霉素的保留时间分别为3.343 min、3.730 min以及7.026 min。3种抗生素的标准曲线如图3所示，表明在标准品浓度范围内，进样浓度与吸收峰面积有良好的线性关系，符合定量检测的条件。

2.2.2 抗生素的降解 培养基中3种抗生素的残留量如图4所示。从图4可以看出，培养基中的金霉素与四环素、土霉素相比更容易降解，在2 d后其降解量达到90%以上，这与金霉素结构不稳定有关。在第4天金霉素的浓度较前3 d有所上升，这是由于四环素抗生素在代谢过程产生的中间代谢产物会重新转化为母体化合物，导致金霉素浓度上升。6 d试验结束后测得金霉素、土霉素、四环素含量均大幅度下降，与对照组相比添加菌株库特氏菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、变形杆菌四种菌的培养基中土霉素和四环素的残留量均有明显降低(P<0.05)，金霉素含量无明显降低趋势(P>0.05)。

2.3 不同条件对四种细菌生长的影响

由表1可知，在较高的抗生素浓度(50 mg/kg)下，粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、库特氏菌三种降解菌的生长均受到抑制，在高温(50 ℃)下这三种降解菌的生长也受到明显的抑制。其中粪肠球菌最适的生长温度为37 ℃，最适生长pH为8左右。鹑鸡肠球菌在较高的温度下(43 ℃)有着更好的生长效果，其最适生长pH为7。库特氏菌在pH=7、pH=8均可以良好地生长，其最适生长温度为37 ℃。在pH=6的培养基中，粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、库特氏菌三种降解菌生长速度低于pH=7、pH=8、pH=9的生长速度。屎肠球菌在高浓度抗生素(50 mg/kg)和高温(50 ℃)条件下生长状况明显好于其他三种菌，表现出对于高浓度抗生素和高温的耐受性，其在pH=7、8、9时均能良好生长，酸性条件(pH=6)对其生长有一定抑制作用。

2.4 堆体温度的变化

堆肥初期温度迅速上升，在第一天堆体温度达到50 ℃左右(图5)，在低抗生素浓度(20 mg/kg)下外源添加降解菌株与对照组无明显差异，在第3～4天温度达到最高温度60 ℃左右，整个堆肥进程中，对照与处理组温度变化较为一致，并无显著性差异。

2.5 堆体抗生素的变化

在20 mg/kg下，7 d对照组与处理组土霉素的残留率分别为43.2%和37.3%，四环素的残留率分别为26.3%、27.7%。14 d对照组与处理组土霉素的残留率分别为16.8%、17.3%，四环素残留率为17.2%、17.9%。在40 mg/kg下，7 d处理组金霉素降解率就达到96.75%，对照组与处理组的土霉素残留率分别为25.7%、20.5%，四环素残留率分别为16.9%和16.5%。14 d对照组与处理组土霉素残留率分别为11.5%和9.6%(图6)。

3 讨 论

抗生素的降解方式有多种，包括吸附降解、水解、光解和生物降解等，其中生物降解是抗生素在环境中降解的重要途径[10]。已报道的四环素类抗生素降解菌包括蜡样芽孢杆菌、缺陷短波单胞菌、人苍白杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌等[11-14]。本研究中筛选获得的鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、库特氏菌、屎肠球菌在四环素类抗生素降解菌的研究报道中较少见，扩大了四环素类抗生素降解菌的菌源，使得在堆肥过程中利用外源微生物降解四环素类抗生素时有更多菌种选择。

降解菌的生长状况受温度、初始pH、初始抗生素浓度等因素的影响，且不同菌种的最适生长条件可能不同。本研究发现粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、库特氏菌生长的最适温度均为37 ℃，而屎肠球菌的最适生长温度为37 ℃和43 ℃，四种菌在50 ℃条件下的生长状况均受到抑制。屎肠球菌在43 ℃的生长状况良好，表明其对较高温度(43 ℃)的耐受性好。吴学玲等[14]研究了四环素类降解菌拉乌尔菌XY-1受温度变化的影响情况，发现其最适生长温度是25 ℃，并随温度升高其对四环素的降解率呈现先升高再平稳后缓慢降低的趋势，降解菌XY-1在第8 d对四环素的降解率达到70.68%。粪肠球菌、库特氏菌、屎肠球菌生长的最适pH为8，而鹑鸡肠球菌生长的最适pH为7，四种菌在酸性条件下(pH=6)均受到抑制作用，其中在粪肠球菌生长的前6 d，酸性条件对其抑制明显，但抑制作用随着时间的推移逐渐减弱，这可能是由于粪肠球菌在生长过程中会释放某些碱性物质。高浓度(50 mg/kg)的抗生素对粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、库特氏菌均具有很强的抑制作用，屎肠球菌在高抗生素浓度(50 mg/kg)条件下长势较好，说明其对高抗生素浓度(50 mg/kg)具有较好的耐受性。

堆肥技术可以有效降解畜禽粪便中的抗生素，但是在实际应用中其降解时间较长。有研究报道，在堆肥中加入降解菌剂后四环素类抗生素的降解效果明显加快[10]。张树清等[15]研究了高温堆肥条件下复合微生物菌剂对堆肥材料中抗生素的降解效果，结果表明外源添加降解菌剂有助于抗生素的去除。本研究将筛选的四株降解菌等比例制成复合菌剂添加到不同抗生素浓度的猪粪中进行堆肥处理后发现，其对于较高浓度(40 mg/kg)的抗生素具有更好的处理效果。在20 mg/kg(低浓度)下，处理组与对照组的四环素类抗生素去除率差异不显著。在40 mg/kg(高浓度)下，金霉素在7 d降解率就达到96.75%。 在土霉素浓度为40 mg/kg下，在7 d对照组与处理组的土霉素降解率分别为74.26%、79.46%，土霉素降解率差异极显著，但在14 d对照组与处理组差异不显著，土霉素降解率分别为87.1%和85.8%，表明在堆肥过程中外源添加本研究所筛选的菌种可以加快土霉素的降解速率，但对最终的土霉素去除效果影响不显著。在四环素浓度为40 mg/kg下，堆肥7 d后对照组与处理组的四环素去除率分别为83.09%和83.49,差异不显著，堆肥14 d后去除率分别为88.5%和90.4%，差异极显著，表明外源添加本研究筛选的菌株可以增强堆肥猪粪中四环素的降解效果，为构建降解多类抗生素环保菌剂奠定基础，具有较强的潜在应用价值。

4 结 论

本研究结果表明，筛选出的4株四环素类抗生素降解菌，外源添加至猪粪堆肥中可以加速堆肥腐熟，降低猪粪中四环素类抗生素的残留量。