单核细胞增生李斯特菌lmo0732基因克隆、分子特征及遗传进化分析

2020-09-27张星星乔梦凡孟庆玲王晓婷才学鹏

家畜生态学报 2020年9期

李杰,张星星，乔梦凡，孟庆玲，乔军*，李妍，王晓婷，李静，才学鹏

(1. 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2. 新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆石河子 832000；3. 中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)

单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM) 是一种革兰氏阳性胞内寄生菌，能够穿越宿主的血脑屏障、血胎屏障和胃肠屏障[1]，可使新生儿，孕妇和免疫力低下者引起严重的李斯特菌病[2-3]。该菌广泛存在于土壤表面、腐烂的植物、动物粪便等环境中[4-5]，并能在自然界和高温、高渗透压环境中长期存活，给人类食品安全造成极大威胁[3，6]。

作为一种重要的食源性致病菌，LM可经消化道感染，侵入肠上皮细胞，跨越肠道屏障进入机体引起全身性感染[7-8]，LM入侵宿主细胞的过程极其复杂，其涉及致病因子、黏附分子、内化素等多种蛋白分子[9]。内化素位于LM表面，根据锚定方式的不同可将内化素分为四类：C端含LPXTG基序共价锚定在细胞壁的内化素、C端GW基序或WxL基序非共价锚定在细胞表面的内化素、疏水性尾部蛋白和以分泌形式存在的小内化素[10]。其中含有保守LPXTG基序的内化素可将蛋白共价结合到细胞壁肽聚糖上，从而参与细菌感染机体的过程，这在致病过程中发挥着重要作用[11]。

研究发现，LM EGD-e标准菌株含有41个LPXTG保守基序蛋白，但目前仅有部分蛋白的功能被研究，且部分已被证明与毒力有关[11]。Lmo0732蛋白是含LPXTG基序的内化素蛋白[12]，然而其生物学功能至今尚不清楚。因此本研究对含LPXTG基序的内化素蛋白Lmo0732进行克隆、测序，并对分子理化特性及蛋白结构特征进行分析，为深入揭示Lmo0732生物学功能奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基及试剂

LM SB5菌株从发病绵羊脑内分离并保存；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。脑心浸液培养基(BHI)购自青岛高科技园海博生物技术有限公司；DL-2000 DNA Marker、pMD19-T(simple)载体购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生物公司。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank中lmo0732基因序列(登录号：NC_003210.1)设计特异性扩增上游引物lmo0732F：5'-CCTCGAGATGAAAAAAGCATTTCTATGC-3'(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物lmo0732R：5'-GGAATTCTCAGCTATGCTTTTGCTTTT-3'(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)，引物由北京华大基因公司合成。

1.3 LM lmo0732基因克隆及测序

按细菌基因组DNA提取说明书提取LM SB5基因组DNA，以DNA为模板，分别以lmo0732F和lmo0732R为引物扩增lmo0732基因，PCR反应体系为：H2O 9 μL，PCR Mixture 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 50 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将PCR产物在0.5×TBE电泳缓冲液中用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，将目的片段用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收。纯化后的PCR产物与pMD19-T(simple)载体过夜连接，然后转化到DH5α感受态细胞内；通过菌液PCR进一步筛选，将阳性克隆送至华大基因生物公司进行测序。

1.4 Lmo0732蛋白分子特征分析

利用在线软件ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)，Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析Lmo0732蛋白质的理化特性、亲疏水性；根据在线网址PrositeScan(https://prosite.expasy.org/prosite.html)，(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)，SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，(http://www.swissmodel.expasy.org/)预测该蛋白的结构域、跨膜区、预测信号肽、二级结构以及三级结构等分子特征。

1.5 lmo0732基因遗传进化分析

将LM SB5与15株不同来源的LM lmo0732基因用DNAStar 7.1和Clustal X 2.1软件进行核苷酸以及推导的氨基酸序列的对比。利用MEGA 5.0软件根据NJ(Neighbor-Joining)法构建系统进化树(Bootstrap值为1000)，分析不同菌株之间的遗传进化关系。

2 结果

2.1 lmo0732基因扩增、克隆及测序

将lmo0732基因的PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测得到约为1 917 bp的目的条带(图1)。PCR产物与pMD19-T(simple)载体连接，转化到DH5α后通过菌液PCR筛选阳性克隆(图2)，并对阳性克隆进行测序，结果发现条带和预期大小相符。

2.2 lmo0732基因分子特征分析

lmo0732基因全长1 917 bp，编码638个氨基酸。Motif Scan软件分析发现其含有11个潜在的N联-糖基化位点(45-48，77-80，93-96，154-157，176-179，184-187，223-226，229-232，312-315，448-451，534-537)；13个酪蛋白激酶II磷酸化位点(28-31，32-35， 51-54，79-82，172-175，212-215，266-269，357-360，415-418，485-488，502-505，559-562，603-606)；8个豆蔻酰化位点(187-192，279-284，381-386，399-404，411-416，451-456，498-503，510-515)；10个蛋白激酶C磷酸化位点(32-34，117-119，145-147，178-180，403-405，421-423，470-472，514-516，536-538，577-579)；1个酪氨酸激酶磷酸化位点(472-479)；1个细菌Ig-like结构域(471-537)；1个LRR结构域(133-152)；2个MucBP结构域(322-390，396-460)(图3)。

2.3 Lmo0732蛋白理化特性、跨膜区及信号肽分析

ProtParam 软件分析显示，该蛋白理论分子质量为69.6 kDa，分子式为C3102H4867N797O1004S7，理论等电点为4.58，为酸性蛋白；总疏水性平均数(GRAVY)为-0.249，属于亲水性蛋白，与ProtScale预测亲疏水性结果一致。TMHMM分析发现，Lmo0732蛋白在氨基酸位置为609～631处存在1个跨膜区域。SignalP分析发现，在其N端1-25氨基酸处存在信号肽。

2.4 内化素之间结构域的比较

将Lmo0732与InlA(lmo0433)、InlB (lmo0434)和InlC(lmo1786) 3个不同内化素进行比较，发现这4个内化素在N端均有信号肽和LRR结构域。Lmo0732和InlA均为C端含LPXTG基序的内化素，但其结构域存在差异：Lmo0732含有MucBp结构域和Big 3结构域，InlA含有LRR-IR和B重复结构域；Lmo0732与InlB、InlC均不属于同一类内化素，与Lmo0732相比，InlB是C端含有GW基序非共价锚定在细胞表面的内化素，InlC为分泌性的小内化素(图4)。

2.5 Lmo0732蛋白二、三级结构分析

在线软件预测发现，该蛋白二级结构由α-螺旋(18.18%)、β-折叠(7.68%)、延伸链(27.27%)和无规则卷曲(46.87%)组成，因此该蛋白主要以延伸链和无规则卷曲为主；三级结构预测表明Lmo0732蛋白是由无规则卷曲连接多段延伸链及α-螺旋所形成的“V”字型结构(图5)。

2.6 lmo0732基因遗传进化分析

基于lmo0732基因的聚类分析发现，不同地域的LM分离株可分为2个基因群，其中意大利，美国和丹麦等国家LM临床分离株(2016TE340、 2018TE5305-1-4、 2015TE34286、2015TE17781-6、2015TE17781-3、FDAARGOS-555、N53-1、SLCC7 179)之间亲缘性较近，组成一个基因群。LM SB5与标准株(LM EGD-e)、加拿大等国家LM分离株(SLC2372、NC088、01-1468、10-4754、10-5027)之间亲缘关系较近，组成另外一个基因群，表现出一定的遗传多样性(图6)。

3 讨论

LM被世界卫生组织(WHO)列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌的第四大食源性致病菌，也是必检的食源性致病菌之一，对人和动物的危害非常严重[13]。在LM细菌表面蛋白中，含有保守LPXTG基序的内化素是病原菌感染机体过程中发挥重要作用的表面蛋白[11]。已有研究表明，LM EGD-e中存在41种带有LPXTG序列基序的表面蛋白，多于其他G+菌的表面蛋白[10-11]。基因组比较发现，致病LM中约有三分之一的LPXTG蛋白在非致病LM中呈现缺失状态[14-15]。在含有LPXTG基序的LM内化素蛋白中，有一些与毒力有关，如 InlA、InlH、InlJ、Lmo2026和Lmo0171等[10，16-17]，而另一些可能对其在食物或其他环境中的生存发挥重要作用[18]，然而还有许多内化素至今其生物学作用尚未研究。

Lmo0732作为LPXTG基序表面蛋白成员，其具体功能目前尚不清楚。本研究发现，Lmo0732含有2个MucBP结构域，1个LRR结构域和1个Big 3结构域。其中LRR结构域由22个氨基酸的串联重复和保守的亮氨酸残基组成，推测可能参与蛋白质间的相互作用。Big 3结构域属于Ig-like结构域中的一种，主要通过与宿主细胞表面的碳水化合物相互作用从而发挥粘附作用[10]，推测LM入侵机体后该蛋白可能与宿主细胞的粘附有关。此外，在LM EGD-e标准株中共有12个LPXTG蛋白和1个Lmo0576蛋白中包含MucBP结构域，该结构域最初在MUB中发现，以串联重复的方式排列，参与LM对宿主细胞的粘附作用[19-20]；在肺炎链球菌中，含有MucBP结构域的SP1932蛋白也已被证明通过与上皮细胞分泌的粘液相互作用，促进其粘附于宿主细胞[21]；在LM中，Mariscotti等[11]首次证实LPXTG蛋白Lmo1413的MucBP结构域可以与粘蛋白结合，提示Lmo0732蛋白可能与细胞粘附相关。本研究中Lmo0732有1个Big 3结构域和2个MucBP结构域，推测可能参与粘蛋白的结合，增加细菌对黏液的黏附从而促进细菌粘附在宿主细胞表面或延长在肠道内的驻留，这在LM侵入机体过程中发挥重要作用。