高效液相色谱–串联质谱法同时测定动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺

2020-09-26葛晓晓舒蕊华

化学分析计量 2020年5期

葛晓晓，舒蕊华

（江苏省理化测试中心，南京 210042）

作为常见的抗病毒药物成分，金刚烷胺是一种饱和三环癸胺的氨基衍生物。与金刚烷胺结构相似，金刚乙胺通过将金刚烷胺的氨基替换为乙胺基而得，也曾作为抗病毒药物于1993 年被美国食品药品监督管理局批准用于A 型流感病毒的预防和治疗［1］。近年来，随着金刚烷胺和金刚乙胺等抗病毒药物在畜禽养殖行业的大量使用，大部分流感病毒对其已产生耐药性，治疗效果日趋降低［2］。金刚烷胺类药物应用于兽医临床试验，缺乏科学、规范、安全、有效的试验数据，可能会对消费者的生命健康带来潜在风险［3–4］。鉴于以上因素，目前多数国家已明令禁止金刚烷胺和金刚乙胺等抗病毒药物在畜禽养殖行业的使用［5］。然而，由于金刚烷胺和金刚乙胺合成路线简单、成本低廉，其在畜禽养殖中被违法投喂现象仍时有发生。由此可见，对于动物源性食品中金刚烷胺和金刚乙胺残留含量的检测具有重要的现实意义。

我国对于动物源性食品中金刚烷胺和金刚乙胺残留含量的检测方法主要有液相色谱法和液相色谱–串联质谱法。高效液相色谱法抗干扰能力差，易受基质效应影响，且容易出现假阳性。液相色谱–串联质谱法虽具有更高的灵敏度和效率［6］，但样品处理方法对检测结果影响较大，一般采用C18（反相硅胶键合）柱或阳离子交换固相萃取小柱［7］净化样品或在样品提取液中直接加入吸附剂［8］进行净化。目前我国对于动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺联合测定方法的研究仍不多见。笔者建立高效液相色谱–串联质谱联合测定法，对动物源性食品中的金刚烷胺和金刚乙胺进行同时测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱–三重四级杆串联质谱仪：Agilent 1290–6470 型，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：BAS224S–CW 型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯集团；

高速分散均质机：FJ–200 型，上海标本模型厂；

高功率数控超声波清洗器：KQ–400KDE 型，昆山市超声仪器有限公司；

高速离心机：TGL–18 型，上海安亭科学仪器厂；

漩涡仪：WH–3 型，上海沪西分析仪器厂有限公司；

旋转蒸发仪：RE–2000B 型，上海亚荣生化仪器厂；

循环水式多用真空泵：SHB–IIIA 型，上海豫康科教仪器设备有限公司；氮吹浓缩仪：AutoVapS60 型，美国ATR 公司；有机系针头过滤器：内径为0.22 μm，美国Crystalgen 公司；

金刚烷胺标准样品：纯度为98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

金刚乙胺标准样品：纯度为99.4%，美国斯坦福化学化工公司；

D15-金刚烷胺标准溶液：0.3 mg／L，农业部农产品质量标准研究中心，使用时以甲醇稀释成所需浓度；

无水硫酸钠、正己烷、乙酸、乙腈：均为分析纯，国药集团；

N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）：粒径为40～63 μm，美国安捷伦科技有限公司；

反相硅胶键合吸附剂（C18）：粒径为40～60 μm，美国安捷伦科技有限公司；

甲醇、乙腈、甲酸：均为色谱纯，美国Honeywell公司；

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱

色谱柱：Agilent T3 柱(100 mm×2.1 mm，3 μm，美国安捷伦科技有限公司)；色谱柱温度：40℃；进样体积：1 μL；流动相：体积分数为1%的甲酸溶液–甲醇，流量为0.4 mL／min，梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱

质谱扫描采集方法：质谱多反应监测模式（MRM）；质谱离子源：ESI 电离源，采用正离子模式；喷雾器压力：0.31 MPa；脱溶剂气体：氮气，温度为300℃，流量为5 L／min；碰撞气：高纯氮气；鞘气：高纯氮气，温度为350℃，流量为12 L／min；毛细管电压：3 500 V；其它质谱参数列于表2。

表2 质谱参数

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理方法

称取均质样品2 g(精确至0.001 g)于50 mL离心管中，准确移取20μL 1 μg／mL 的D15-金刚烷胺标准溶液（作为内标物），加入的乙酸–乙腈溶液（1∶100）20 mL，超声10 min，过滤，加入无水硫酸钠3 g、正己烷10 mL，涡旋1 min，以3 500 r／min转速离心3 min。移除上层的正己烷层，将乙腈层倒入50 mL 茄形瓶中，于40℃旋干，准确加入1.0 mL 甲醇复溶。加入PSA 75 mg 及C1875 mg，涡旋30 s，取上清液，过0.22 μm 滤膜。精密量取滤液0.5 mL于离心管中，用30℃氮气吹干，加入甲醇溶液0.5 mL，涡旋30 s，以10 000 r／min 转速离心3 min，取上清液待测。

1.3.2 系列混合标准工作溶液的配制

溶剂标准工作溶液：分别配制金刚烷胺和金刚乙胺混合标准溶液和D15-金刚烷胺标准溶液各10 μg／mL 的母液，准确移取金刚烷胺和金刚乙胺混合标准溶液2，4，10，20，100，200 μL，D15-金刚烷胺标准溶液20 μL 于6 只10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液稀释定容，配制成金刚烷胺和金刚乙胺质量浓度均分别为2，4，10，20，100，200 μg／L，D15-金刚烷胺质量浓度均为20 μg／L 的系列混合标准工作溶液。

基质匹配标准工作溶液：取阴性空白样品，除在样品处理结束后加入D15–金刚烷胺标准溶液外，其余步骤均与上述过程相同，制得空白基质溶液，用空白基质溶液配制与溶剂标准工作溶液浓度相同的系列基质匹配标准工作溶液，临用现配。

2 结果与讨论

2.1 样品处理

参考农业部2483 号公告–6–2016［9］及GB 31660.5–2019［10］的要求，对萃取溶剂进行优化。分别试验了甲醇、乙腈、乙酸–甲醇（1∶100）、乙酸–乙腈（1∶100）的提取效果。结果表明，当加标量为1 μg／kg 时，纯溶剂提取时回收率较差。向溶剂中加入酸可以提高回收率，而加入乙酸的效果优于甲酸。乙酸–乙腈溶液（1∶100）提取效果略优于乙酸–甲醇溶液（1∶100）［11］，平均回收率为91.6%。因此选择乙酸–乙腈溶液（1∶100）为提取溶剂。

参考GB 31660.5–2019 及文献［12］［13］，比较了PSA，C18的净化效果，结果表明同时加入等量的PSA 和C18回收率最好，因为肉类等样品基质相对复杂，加入PSA 和C18可以最大程度地去除多种有机酸、脂质、色素、甾醇等［14］。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱

试验考察了美国沃特斯有限公司的Waters Atlantis T3 柱(100 mm×2.1 mm，3 μm) 和Waters Sunfire C18柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)及美国安捷伦科技有限公司的Agilent Poroshell 120 EC–C18柱（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）3 种不同色谱柱对金刚烷胺和金刚乙胺的分离测定效果。结果表明，在同等条件下，上述3 种C18柱分离效果均较为良好。Agilent Poroshell 120 EC–C18柱耐高压，但在本试验梯度时间内，短柱对于基质分离的表现差于长柱。T3 柱和Sunfire C18柱在低pH 条件下均有良好的稳定性。使用T3 柱和Sunfire C18柱时金刚烷胺和金刚乙胺的分离度和响应无明显差异，但Sunfire C18柱压较低。T3 柱更适用于强极性物质的分离，本实验中的目标物不是强极性物质，选择普通C18柱可以达到检测目的，所以选择Sunfire C18柱。

2.2.2 柱温

分别选择柱温为30，35，40℃，考察金刚烷胺和金刚乙胺的分离效果。结果表明，在其它条件不变时，改变柱温色谱峰响应与保留时间没有明显变化，但柱温较高时，流动相的溶解度增大，柱压明显降低。考虑到色谱柱使用寿命，采用柱温为40℃。

2.2.3 流动相及其组成

分别采用甲醇–水、乙腈–水作为流动相，发现色谱响应一般，色谱峰形较宽。由于金刚烷胺和金刚乙胺含有氨基，向流动相中加入适量酸能促进离子化效应并提高响应值［15］，因此在水相中加入适量的甲酸。采用体积分数1%的甲酸溶液–乙腈作为流动相时，色谱保留时间比采用体积分数1%的甲酸溶液–甲醇提前，而肉类样品基质复杂，较早出峰可能会有干扰［16］，因此采用体积分数1%的甲酸溶液–甲醇作为流动相。

2.2.4 进样体积

GB 31660.5–2019 采用的进样体积为10 μL，而常规进样体积为1 μL，分别取进样体积1，5，10 μL 试验，结果表明，进样体积为10 μL 时，即因仪器具有高灵敏度而导致过载,进样体积为5 μL 时，在测定某些基质较复杂的样品时，会因杂质响应过高而干扰目标物的检测。进样体积为1 μL 时，目标物的响应能满足要求，并且基质干扰较小。故选择进样体积为1 μL。

图1 为在最佳实验条件下金刚烷胺和金刚乙胺混合标准溶液的质谱多反应监测色谱图。

图1 金刚烷胺和金刚乙胺混合标准溶液质谱多反应监测色谱图

由图1 可见，金刚烷胺出峰时间为1.34 min，金刚乙胺出峰时间为3.35 min，两者分离效果良好。

2.3 线性关系与检出限

在1.2 仪器工作条件下，按照浓度由低到高的顺序依次对1.3.2 配制的两组系列混合标准工作溶液进行测定。金刚烷胺采用内标法定量，以标准工作溶液的质量浓度（x，μg／L）为自变量、以定量离子对色谱峰面积与内标峰面积的比值（y）为因变量进行线性回归，得线性方程和相关系数；金刚乙胺采用外标法定量，以标准工作溶液的质量浓度（x，μg／L）为自变量、以定量离子对色谱峰面积（y）为因变量进行线性回归，得线性方程和相关系数。

基质效应用基质匹配标准工作溶液线性斜率除以溶剂配制标准工作溶液线性斜率计算［17–18］。

实验发现用甲醇与用阴性基质溶液配制标准工作溶液相比较，前者基质效应较小，在样品检测时，可采用甲醇配制标准溶液以简化操作。

采用标准添加法确定方法检出限和定量限。以信噪比S／N≥3 确定样品中金刚烷胺和金刚乙胺的检出限，以信噪比S／N≥10 确定其定量限。

金刚烷胺和金刚乙胺的线性方程、线性范围、相关系数、检出限、定量限数据列于表3。