高效液相色谱–串联质谱法同时测定水体中氯霉素类抗生素

2020-09-26李莉郑璇张晓岭邹家素

化学分析计量 2020年5期

李莉，郑璇，张晓岭，邹家素

（重庆市生态环境监测中心，重庆 401147）

氯霉素类抗生素主要包括氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜氯霉素，它们能与细菌核糖体结合，干扰蛋白质合成而抑制细菌生成。氯霉素作为第一个人工合成的抗菌药物，表现出广谱的抗菌能力；甲砜霉素为氯霉素苯环上的硝基被一甲砜基取代后的产物，体内抗菌活性比氯霉素更强，水溶性和稳定性比氯霉素更高，是氯霉素类的第二代广谱抗菌药；氟甲砜霉素是甲砜霉素的单氟衍生物，对甲砜霉素和氯霉素耐药的菌株仍对氟甲砜霉素敏感。氟甲砜霉素的抗菌谱与抗菌活性略优于氯霉素和甲砜霉素，是氯霉素类的第三代广谱抗菌药［1–3］。

氯霉素类抗生素被广泛应用于水产养殖和畜禽养殖中，但氯霉素类抗生素对人体造血功能有较大损害，因而威胁人类的健康，欧盟、美国等国家和地区先后将其列为禁用药物［4–5］。随着畜禽、水产养殖业的快速发展，我国抗生素的种类和用量的日益增加，人类和动物所使用的大部分抗生素类药物未经代谢便通过粪便或者尿液排出体外，进入环境，对地下水和地表水体造成一定程度的污染，进而影响人类的饮用水安全［6］。为适应新时期环境保护的需要，开展水环境中氯霉素残留的检测研究具有非常重要的意义。

高效液相色谱–串联质谱（HPLC–MS／MS）法具有特异性强、灵敏度高、抗干扰能力强等特点，已广泛应用于氯霉素残留的分析［7–9］。牛奶、鸡蛋、肉制品、水产品等食品都建立了利用该方法测定氯霉素的标准［10–14］，但水中抗生素的测定研究尚在起步阶段［15］，测定方法多为多类抗生素混合测定，或目标物为单一氯霉素。笔者利用固相萃取（SPE）对样品进行浓缩净化，结合LC–MS／MS 分析技术，以氯霉素–D5 为内标，对样品萃取剂的流量、固相萃取洗脱溶剂、液相分离流动相、质谱条件等方面进行探讨和试验，并确定了样品保存时间，建立了一种简单、快速、准确地同时定量检测水环境中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜氯霉素3 种抗生素残留的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱–串联质谱仪：TSQ ACCESS 型，美国Thermo Scientific 公司；

固相萃取柱：Oasis HLB 型，6 mL／150 mg，美国Waters 公司，使用前需分别用10 mL 甲醇和10 mL 超纯水活化；

滤膜：孔径为0.2μm，亲水性聚丙烯（GHP）针式微孔滤膜；

甲醇：农残级，韩国Duskan Minchem Corp 公司；

乙酸铵–甲醇溶液：取80 mL 乙酸铵溶液（5 mmol／L）与20 mL 甲醇混合；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准物质：纯度分别为98.5%，99.0%，99.8%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；

氯霉素-D5标准溶液：100 ng／μL，介质为乙腈，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准储备液：质量浓度均为1.00 mg／mL，取对应标准物质适量，用甲醇溶解定容制得；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的质量浓度均为100 μg／mL，取氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准储备液适量，混合，用甲醇稀释制得；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素系列混合标准工作溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的质量浓度均为1.0～100 μg／L，取对应标准溶液及氯霉素-D5标准溶液适量（作为内标物），用甲醇稀释制得；

实验用水为超纯水。

1.2 样品前处理

水样经0.45 μm 滤膜过滤，取1 000 mL 滤液，调节pH 至4～7，用固相萃取柱进行富集萃取。水样以低于10 mL／min 的流量通过HLB 小柱，待全部样品过柱后，用10 mL 超纯水淋洗小柱，用氮气吹干，再用10 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于洁净试管中，在氮气浓缩仪上吹至近干，然后用乙酸铵–甲醇溶液定容至1 mL，加入氯霉素-D5标准溶液5.00 μL 作为内标，经0.22 μm 滤膜过滤，置于样品瓶中，待测。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 液相色谱

色谱柱：Thermo C18液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm，美国Thermo Scientific 公司）；进样体积：10μL；流动相：5 mmol／L 乙酸铵溶液–甲醇，流量为250 μL／min，梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱流动相梯度洗脱程序

1.3.2 质谱

电喷雾：负离子模式（ESI–）；离子传输毛细管温度：350℃；气化室温度：200℃；鞘气：氮气，压力为4.5 MPa；辅助气：氮气，压力为1.5 MPa；喷雾电压：3 000 V；监测模式：选择反应监测（SRM）；碰撞气：氩气，压力为200 Pa。3 种抗生素的质谱参数见表2。

表2 3 种抗生素的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 离子源极性的选择

分别采用电喷雾电离源（ESI）的正离子和负离子模式，上机检测组分质量浓度均为100 μg／L 的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准溶液（含内标氯霉素-D5100 μg／L），发现在正离子模式下，各化合物均无明显出峰，且响应值均远小于负离子模式，而在负离子模式下3 类目标物分离很好，如图1。氯霉素类抗生素均含有酚羟基和氯原子，具有较强的电负性，故应采用负离子模式检测。

图1 3 种抗生素的SRM 色谱图

2.2 流动相的选择

分别以5 mmol／L 乙酸铵溶液–甲醇、甲醇–水、甲醇–0.05%甲酸溶液为流动相，采用相同的梯度洗脱程序，分析组分质量浓度均为100 μg／L 的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准溶液（含内标氯霉素-D5100μg／L），实验发现，以甲醇–0.05%甲酸溶液为流动相时，3 种物质分离不完全；以5 mmol／L 乙酸铵溶液–甲醇为流动相时，色谱峰形比以甲醇–水为流动相时要好。因此以5 mmol／L乙酸铵溶液–甲醇为流动相。

2.3 固相萃取条件的选择

2.3.1 水样pH 值

有文献报道固相萃取时调节水样的pH 值至4.0时，氯霉素类抗生素可得到满意的回收率［4］，故进行了如下试验：分别配制pH 值为4.0，6.0，7.0，8.0，10.0 的空白加标样品，按1.2 方法进行样品前处理后上机测试。平行测定3 次，计算抗生素的平均加标回收率，不同pH 条件下抗生素的回收率如图2所示。结果表明，当pH 为4.0～7.0 时，样品加标回收率稳定在80%左右，变化不大，但当pH ＞7.0 时，样品加标回收率明显降低。因此适宜的水样pH 值为4～7。不需要将水样的pH 特别调至酸性。

图2 水样不同的pH 值对应的抗生素回收率

2.3.2 样品萃取的流量

水样经过萃取小柱的流量直接影响小柱对目标化合物的富集效率。试验考察了样品流量分别为2，5，10 mL／min 时空白加标样品的回收率，结果如图3 所示。结果表明，3 种样品流量的抗生素加标回收率均在87%～125%范围，满足样品测定要求。考虑到提高分析效率的因素，选取样品萃取流量为10 mL／min。

图3 样品萃取不同流量时抗生素的回收率

2.3.3 淋洗液pH 值的影响

配制10 ng／L 的空白加标溶液，分别采用pH 7 和pH 2.0 的去离子水作为淋洗液，测定不同淋洗液pH 值对应的抗生素回收率，测定结果如图4 所示。由图4 可知，淋洗液的pH 值对样品种抗生素的回收率影响不大。实验选择pH 7 的去离子水作为淋洗液。

图4 不同淋洗液pH 值对应的抗生素回收率

2.3.4 洗脱液的选择

分别选取10 mL 甲醇、10 mL 2%甲酸溶液–甲醇和10 ml 1%氨水–甲醇为洗脱液进行试验，计算3 种洗脱液对应的抗生素回收率，结果如图5 所示。试验表明，10 mL 2%甲酸–甲醇作为洗脱液时，抗生素回收率显著降低，10 mL 甲醇作为洗脱液时加标回收率最优，故选择10 mL 甲醇作为洗脱液。

图5 洗脱液的种类对测定结果的影响

2.4 线性关系

配制质量浓度分别为1.0，2.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg／L 的氯霉素类抗生素系列混合标准工作溶液（其中内标氯霉素-D5的质量浓度均为50.0 μg／L），在设定的色谱条件下，由低浓度到高浓度依次对上述溶液进行测定，以系列混合标准工作溶液中目标组分的质量浓度为自变量，以对应的色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值和内标物浓度的乘积为因变量，进行线性回归，计算线性方程和相关系数。3 种抗生素的线性范围、线性方程和相关系数列于表3。由表3 可知，3 种抗生素的质量浓度在1.0～100.0 μg／L 范围线性良好，相关系数为0.993 5～0.997 7。

表3 种氯霉素类抗生素的线性范围、线性方程和相关系数

2.5 检出限及测定下限

按照HJ 168–2010 空白实验中未检出目标物质的检出限测定方法，配制7 份1 000 mL 3 ng／L平行水样，按样品测定的全过程进行分析，得3 种抗生素的检出限为1.04～1.33 ng／L，测定下限为4.16～5.32 ng／L。

2.6 精密度试验

分别配制5，10.0，20.0 μg／L 的空白加标样品各6 份，按1.2 进行样品前处理，上机分析，测定结果列于表4。由表4 可知，3 种抗生素3 水平加标测定值的相对标准偏差范围3.0%～11.1%，本方法精密度满足分析要求。

表4 空白样品加标回收试验结果

2.7 加标回收试验

选取地表水、废水样品，加入氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准溶液至质量浓度均分别为5，10 ng／L 和10，20 ng／L，配制加标样品各6 份，按1.2 进行样品前处理，上机分析，测定结果列于表5。由表5 可知，3 种抗生素的样品加标回收率为101%～123%，该法准确度满足分析要求。

表5 实际样品加标回收试验结果

2.8 样品保存时间

吸取1.00 mg／L 氯霉素类使用液20 μL，用水定容至1.00 mL，分别置于棕色玻璃小瓶中，分别考察其在4℃冷藏条件下，存放1，2，4，7，14 d 后测定值的变化。结果表明，在14 d 内避光冷藏条件下，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜氯霉素的浓度均无显著变化，因此，样品应采用0～4℃避光保存，于14 d 内分析完毕。