miR-10b对延边黄牛垂体细胞中GH分泌的影响

娄安钢，季久秀，相思宇，金太花，陈莹莹，张 睿，崔长艳，于龙政，关立增,*

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133002；2.临沂大学 农林科学学院，山东 临沂 276005)

延边黄牛具有生长速度慢、生长周期长和出栏率低等缺点，导致饲料资源浪费和饲养成本的提高，这严重制约了延边黄牛养殖业的健康发展[1-3]。因此，如何提高纯种延边黄牛的生长速度、缩短其养殖周期是加快延边黄牛养殖产业快速发展的关键。研究表明，miRNA对动物的生长发育发挥着重要的调控作用。梁如意[4]研究发现，miR-21可以调控猪骨骼肌的生长发育。黄建芳[5]发现，miR-423-5p可能通过靶向特定基因参与骨骼肌的生长发育调控。由此可见，一些miRNA可能与动物生长发育存在着密切的关系。那么miRNA是否具有调控延边黄牛生长速度、提高生长效率的作用，有待进一步研究。

在动物生长发育过程中，生长轴起着关键的作用[6-7]。而在生长轴中腺垂体分泌的GH是最重要的成员之一[8-9]。因此，为更全面地了解miRNA在调节延边黄牛生长过程中的作用，我们在前期试验工作中选择以延边黄牛和在生长发育速度、初生体质量及各年龄段体尺均极显著优于延边黄牛的韩延牛作为研究对象，利用生物信息学技术分析了延边黄牛及韩延牛血液中显著影响GH分泌的差异表达miRNA，并筛选出显著差异表达的miR-10b。但是，关于miR-10b对延边黄牛垂体中GH分泌的影响的具体机制还不清楚。因此，本试验旨在体外垂体细胞水平上探究miR-10b对延边黄牛垂体GH分泌的调控机制，进而为进一步研究miRNA调控动物生长发育机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器Bio-Rad 650型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；倒置生物显微镜(日本Olympus公司)；荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；2406-2型CO2培养箱(美国Thermo公司)；凝胶成像系统(英国Ultro-Violet Products公司)。

1.2 主要试剂XhoⅠ、XbaⅠ购自大连宝生物公司；DMEM/F-12、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ及青霉素、链霉素、LipofectamineTM2000，均购自GIBCO公司；GH抗体、SSTR2抗体购自Abcam公司；β-actin抗体购自博奥森公司；总蛋白提取试剂盒购自北京佳兰生物科技有限；miR-10b的 mimics、inhibitor、NC、iNC均由上海吉玛制药技术有限公司合成；双荧光报告基因检测试剂盒购自 Promega公司。

1.3 延边黄牛原代垂体细胞的培养原代垂体细胞的培养按参考文献[10]进行。在无菌条件下分离3头延边黄牛的垂体组织，分别剪碎至1 mm×1 mm×1 mm组织块，用pH7.0的PBS冲洗3遍后，接种于75 cm2培养瓶中，加入DMEM/F12培养液，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞从组织块中爬壁生长至80%时，用0.25%的胶原酶消化，并通过差速贴壁法分离细胞，获得垂体原代培养细胞。

1.4 miR-10b对延边黄牛腺垂体细胞中GH mRNA转录水平的影响按1.3所述方法对延边黄牛的垂体组织细胞进行原代培养后，按2.0×106细胞/孔的密度将垂体细胞接种至6孔培养板中，待细胞汇合度为60%～70%时进行转染试验。转染前用2 mL 的PBS漂洗细胞1次，并加入0.8 mL的DMEM/F12培养液。之后分别将200 pmol/L的miR-10b的模拟物(mimics)、相应的反义序列(inhibitor)、NC对照、iNC对照分别稀释到100 μL 的DMEM/F12培养液中。然后将10 μL转染试剂LipofectamineTM2000稀释到100 μL 的DMEM/F12培养液中，之后将上述稀释液分别按1∶1比例混合，室温孵育10 min后，将200 μL混合物加入到上述预处理的细胞孔中，每组设3个重复。为了避免转染毒性，6 h后吸弃含转染试剂的培养基，同时置换新的培养基继续培养48 h，收集细胞，提取总mRNA。采用荧光定量PCR(qPCR)法检测GH mRNA的转录情况，具体步骤参考文献[10]的方法进行。

1.5 miR-10b对延边黄牛腺垂体细胞中GH蛋白表达的影响根据总蛋白提取试剂盒的步骤对1.3方法获得的细胞进行总蛋白提取，并进行GH蛋白的Western blot检测。具体步骤：按常规方法配制10%PAGE分离胶和5%PAGE浓缩胶并放入垂直电泳槽中，待其凝固后，拔出木梳并向梳孔中加入1×甘氨酸缓冲液，然后加入50 μg制备的总蛋白样品进行电泳。电泳结束后，将上述蛋白胶进行转膜，所用膜为PVDF，转膜时间为110 V、60～70 min，转膜结束后取出PVDF膜，进行丽春红染色，检验转膜效果。之后用1×TBST溶液洗涤膜数次，去除丽春红染色液，再用5%脱脂奶粉室温条件下封闭2 h。之后将封闭的PVDF膜放入5 mL离心管中，加入2 mL GH蛋白一抗，4℃条件下孵育过夜(12 h)。孵育结束后，用1×TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min。将洗涤后的PVDF膜放入新的5 mL 离心管中，加入2 mL 1∶5 000稀释的GH蛋白二抗，室温孵育2 h。孵育结束后，用1×TBST洗涤PVDF膜3次，每次5 min。然后将PVDF膜置于发光液中显色1 min后，在凝胶成像系统中曝光，并与β-actin内参基因的表达进行比较，计算GH蛋白的相对表达量。

1.6 miR-10b的靶基因预测利用 targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-10b与GH合成分泌相关的基因(GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1和SSTR5)的靶关系进行预测。

1.7 miR-10b与SSTR2 靶关系的验证将能与miR-10b种子序列匹配的SSTR2 3′UTR区域的上、下游30 bp之内的序列进行人工合成，同时将与miR-10b种子序列匹配区域的5个碱基进行人工突变作为对照，逐步确定miR-10b真正结合位点。然后用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ酶切上述人工合成的片段以及人工突变片段，将酶切产物分别与荧光素酶基因报告载体(pirGLO载体)连接，构建重组pirGLO-SSTR2-3′UTR表达载体和突变载体，获取无内毒素质粒。之后将miR-10b的 mimic、NC与构建好的pirGLO-SSTR2-3′UTR正常或缺失载体分别稀释成200 pmol/L，然后在转染试剂LipofectamineTM2000的作用下共转染CHO细胞，具体转染过程参考方法1.4。48 h后收集细胞、裂解，按萤光素酶检测试剂盒步骤检测荧光素酶的活性，以验证miR-10b与SSTR2之间的靶关系。

1.8 miR-10b对延边黄牛腺垂体细胞中SSTR2基因mRNA转录水平和蛋白表达的影响SSTR2 mRNA转录水平的qPCR检测和蛋白的Western blot检测均参考1.4和1.5的方法进行。

2 结果

2.1 miR-10b对GH基因mRNA转录水平的影响为了分析miR-10b对延边黄牛垂体GH表达的影响，本试验首先用miR-10b mimics及inhibitor转染原代培养的延边黄牛垂体细胞，然后对GH基因mRNA表达水平进行检测。结果显示，miR-10b水平的增加能够显著提高GH mRNA的转录水平(图1A)，反之降低miR-10b水平具有抑制GH mRNA的转录水平(图1B)。

图1 miR-10b对GH mRNA转录水平的影响 A.垂体细胞转染miR-10b-mi后，GH mRNA的相对转录水平；B.垂体细胞转染 miR-10b-in后GH mRNA的相对转录水平。*.P<0.05；**.P<0.01。下同

2.2 miR-10b对GH基因蛋白表达的影响为了进一步验证miR-10b对延边黄牛垂体GH表达的影响，本试验在GH mRNA转录水平检测结果基础上进一步对GH蛋白的表达水平进行了相应Western blot检测。Western blot检测结果显示，增加miR-10b的水平可显著提高GH蛋白的表达水平(图2A)，反之降低miR-10b的水平能够抑制GH蛋白的表达水平(图2B)。

2.3 miR-10b与调控GH分泌相关基因的靶关系预测本试验使用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-10b与GH合成分泌相关的基因(GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1、SSTR5)靶关系进行了分析，结果表明，miR-10b的靶基因为SSTR2。

2.4 miR-10b与SSTR2基因靶关系的验证为了验证miR-10b与SSTR2之间是否存在靶位关系，将pirGLO-SSTR2-3′UTR正常或突变载体分别与miR-10b/NC共转染CHO细胞，从而通过荧光素酶活性的变化来反映miR-10b与SSTR2是否存在靶关系。结果显示，miR-10b能显著降低pirGLO-SSTR2-3′UTR正常质粒荧光素酶的活性(图3A)，而对pirGLO-SSTR2-3′UTR突变载体无抑制效果(图3B)。由此可知，miR-10b能结合并作用于SSTR2 的3′UTR区域，miR-10b与SSTR2之间存在着靶位关系。

图2 miR-10b对 GH 蛋白表达的影响 A.垂体细胞转染 miR-10b-mi后GH 蛋白的相对表达量；B.垂体细胞转染 miR-10b-in后GH 蛋白的相对表达量

图3 荧光素酶活性测定 A.pirGLO-SSTR2-3′UTR正常质粒与miR-10b mimics和NC共转染48 h后荧光素酶的活性变化；B.pirGLO-SSTR2-3′UTR突变质粒与miR-10b mimics和NC共转染48 h后荧光素酶的活性变化

2.5 miR-10b对SSTR2基因mRNA表达的影响为了验证miR-10b对SSTR2基因调控功能，本试验首先用miR-10b mimics及inhibitor转染原代培养的延边黄牛垂体细胞，然后对SSTR2基因mRNA转录水平进行检测。结果显示，miR-10b水平的增加能够显著抑制SSTR2 mRNA的转录水平(图4A)，反之降低miR-10b水平能显著提高SSTR2 mRNA的转录水平(图4B)。

2.6 miR-10b对SSTR2基因蛋白表达的影响为了进一步验证miR-10b对延边黄牛垂体SSTR2表达的影响，本试验在SSTR2 mRNA转录检测结果的基础上进一步对SSTR2蛋白的表达水平进行检测。Western blot结果显示，增加miR-10b的水平能显著抑制SSTR2蛋白的表达水平(图5A)，反之降低miR-10b水平能够显著提高SSTR2蛋白的表达水平(图5B)。

图4 miR-10b对 SSTR2 mRNA转录的影响 A.垂体细胞转染 miR-10b-mi后SSTR2 mRNA的转录水平；B.垂体细胞转染 miR-10b-in后SSTR2 mRNA的转录水平

图5 miR-10b对SSTR2蛋白表达的影响 A.垂体细胞转染 miR-10b-mi后SSTR2蛋白的相对表达量；B.垂体细胞转染 miR-10b-in后SSTR2蛋白的相对表达量

3 讨论

垂体是哺乳动物体内重要的内分泌腺体，垂体对动物机体正常生长发育是必要的，是动物生长轴的主要成分之一[11]。垂体分泌的GH是调控动物生长的重要因素之一，GH可通过与生长激素结合蛋白(GHBP)结合而运输，与靶器官上生长激素受体(GHR)结合，促使胰岛素样生长因素(IGFS)的产生并进入血液循环，IGFs再通过与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)结合转运到全身组织细胞，刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等[12-13]。研究表明，GH mRNA转录水平或蛋白表达水平受多种因素的调节作用,其中miRNA是主要调节因素之一[14]。miRNA可与其相关的靶基因形成复杂的调控网络，通过调控靶基因的mRNA表达水平影响其蛋白的表达，从而间接影响细胞增殖、分化、凋亡等一系列生命活动。miRNA对生长调控作用的研究已有相关报道，如ssc-let-7c能通过调节GHRH的表达影响GH的分泌，进而调节猪的生长发育[15]。同时本课题组在对生长性能有显著性差异的延边黄牛和韩延牛中的miRNA进行差异分析时，也发现在2个品种牛的miRNA存在着显著性差异。因此，本课题组选择以在延边黄牛和韩延牛中有显著性差异的miRNA去研究其对延边黄牛生长性能的调控具有一定意义。

根据我们前期研究的基础可知，miR-10b在延边黄牛和韩延牛之间呈现显著性差异表达，因此我们推测miR-10b可能参与了生长调控过程，可能是造成延边黄牛和韩延牛生长性能差异的主要因素之一。但是，miR-10b是如何调控延边黄牛垂体GH分泌的机制还不清楚，因此试验对其进行了进一步研究。为了验证miR-10b是否参与了垂体细胞GH的分泌调节，本试验利用miR-10b mimics和inhibitor对延边黄牛垂体细胞进行了转染试验，并利用实时定量PCR(qPCR)和Western blot技术对延边黄牛垂体细胞中GH的mRNA和蛋白表达水平进行了检测。qPCR和Western blot结果显示，通过转染miR-10b mimics能显著增加GH mRNA和蛋白的表达水平，而转染miR-10b inhibitor能降低相应GH mRNA和蛋白的表达水平,该结果表明miR-10b参与了调控垂体细胞中GH的分泌过程。

为了进一步确定miR-10b 参与GH分泌的具体调控过程，本试验通过生物学分析软件对miR-10b与GH分泌相关的调控基因进行了靶关系分析。研究资料显示，与GH合成分泌相关的基因主要有GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1和SSTR5[16]。鉴于此，本课题组利用 targetscan和RNAhybrid分析软件分别对miR-10b与GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1和SSTR5的靶关系进行分析。分析结果显示，miR-10b的种子序列只与SSTR2基因存在靶关系。而通过荧光素酶报道基因验证结果显示，miR-10b能显著降低pirGLO-SSTR2-3′UTR正常质粒荧光素酶的活性，而对缺失载体的荧光素酶活性无显著性影响。上述结果初步说明miR-10b与SSTR2之间存在着靶位关系。

虽然，本试验通过生物信息学分析和报告基因系统验证了miR-10b与SSTR2基因的靶关系，但在垂体细胞水平上miR-10b对SSTR2基因表达的具体影响结果仍然未知。因此，我们通过对延边黄牛垂体细胞进行miR-10b mimics和inhibitor的转染试验，利用定量PCR和Western blot检测SSTR2基因的mRNA和蛋白的表达变化。结果显示，通过转染miR-10b-mi能显著抑制SSTR2 mRNA和蛋白的表达水平，而转染miR-10b-in能显著增加SSTR2 mRNA和蛋白的表达水平。因此，此结果进一步证明miR-10b与SSTR2基因之间存在靶关系。该结果也进一步说明miR-10b可通过抑制SSTR2的表达从而促进GH分泌，但其具体调控网络及其调控机理还有待进一步研究探讨。

本试验结果表明，miR-10b可以通过靶向SSTR2进而调节GH的表达。这将为进一步研究miRNA调控动物生长发育机制提供理论依据，也将为延边黄牛生长发育调控提供新的作用靶标。