鉴别蓝舌病野毒感染ELISA检测方法的建立与初步应用

黄超华，史卫军，曹琛福*，王 潇，花群义，林彦星,陈金顶*

(1.华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642；2.深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045)

蓝舌病(bluetongue，BT)是蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)引起的一种虫媒性烈性传染病。反刍动物BT的平均死亡率在30%左右，其中绵羊的发病死亡率高达80%。我国于1979年在云南省首次发现该病[1]，迄今为止已扩散到31个省市地区。血清学调查结果显示，我国至少存在有1,2,3,4,9,11,12,15,16,21,23等11个BTV血清型，其中1和16型为主要血清型[3]。弱毒疫苗和灭活疫苗是防控蓝舌病的主要手段，其中欧洲食品安全局推荐使用灭活疫苗[4-5]。NS3蛋白是BTV的非结构蛋白，其氨基酸序列及核苷酸序列均高度保守，具有群抗原特异性[6-7]。作为一种非结构蛋白，NS3蛋白并未被装配到病毒粒子中，因此在灭活疫苗接种和自然感染的动物体内产生的针对NS3的抗体水平存在着一定的差异[8]。本试验是以重组的NS3蛋白为包被抗原，建立一种间接ELISA鉴别检测方法，通过检测血清中抗NS3的抗体水平以区分动物是BIV自然感染还是疫苗接种。

1 材料与方法

1.1 菌株及血清感受态细胞DH5α和BL21(DE3)购自北京全式金公司；BIV阳性血清、蓝舌病灭活疫苗接种的绵羊免疫血清、绵羊蓝舌病阴性血清、口蹄疫阳性血清、水泡性口炎阳性血清、羊痘阳性血清和小反刍兽疫阳性血清由均由本实验室保存。

1.2 主要仪器与试剂酶标仪购自BioTek公司；凝胶成像系统购自BioRad公司；PCR仪购自ABI公司；限制性内切酶、质粒小量提取试剂盒、DNA Marker等购自宝生物公司；蛋白Marker购自全式金公司；Ni-NTA Fast Start Kit(6)试剂盒购自德国QIAGEN 公司；HRP标记兔抗绵羊IgG购自Invitrogen公司；TMB显色试剂盒购自上海生工公司；Overnight ExpressTMInstant LB Media和TMB显色底物购自Merck公司；蓝舌病ELISA抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司。

1.3 BTV NS3原核表达载体的构建分析BTV S10基因序列，并根据大肠杆菌的密码子偏好性，对编码NS3蛋白的基因序列密码子进行优化。优化后的NS3基因序列由上海生工公司合成，获得重组质粒pUC-NS3。按照常规的亚克隆技术构建原核表达重组质粒pETDuet-NS3。将pETDuet-NS3转化至感受态细胞BL21(DE3)，并筛选出含pETDuet-NS3的表达菌。

1.4 BTV NS3的原核表达与纯化取少量含重组表达质粒pETDuet-NS3的表达菌接种至含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。取过夜培养的菌液按照1∶100的量加入到含Amp的自诱导表达培养基Overnight ExpressTMInstant LB Media中，25℃过夜诱导表达。离心收集菌团，使用Ni-NTA Fast Start Kit(6)试剂盒纯化重组NS3蛋白，并通过Western blot方法确认NS3蛋白的纯化效果和抗原性。

1.5 基于NS3蛋白的间接ELISA方法的建立

1.5.1最佳包被抗原质量浓度和血清稀释度的选择 以纯化的NS3蛋白作为包被抗原，用碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH 9.6)将包被液分别稀释至0.10，0.25，0.50，1.00，2.00 mg/L，每个稀释度横排包被12孔。纵排分别用BTV阳性、阴性血清作1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320倍稀释后与稀释的重组蛋白组成方阵，通过棋盘滴定法确定最佳抗原和血清稀释度。选取BTV阳性血清D450值(P值)较大，阴性血清D450值(N值)较小，P/N值较大的组合作为最佳包被质量浓度和待检样品的稀释倍数。

1.5.2其他反应条件的优化 用最佳质量浓度抗原包被96孔酶标板，在其他反应条件不变情况下，分别用5%BSA、5%脱脂乳和WB无蛋白封闭液封闭，200 μL/孔，37℃孵育2 h,根据P/N值大小，筛选出最佳封闭液；将HRP标记兔抗绵羊二抗用1%BSA分别按照1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000稀释，100 μL/孔，37℃孵育30 min,根据P/N值大小，筛选出最佳酶标二抗工作浓度；设置20，30，45 min 3个孵育时间，根据P/N值大小，分别确定最适宜的血清孵育时间和二抗孵育时间；加入TMB显色液，100 μL/孔，室温条件下避光显色 5，10 min,根据P/N值大小确定最佳显色时间。

1.7 特异性试验使用建立的间接ELISA方法分别检测口蹄疫、水泡性口炎、羊痘、小反刍兽疫几种临床症状与蓝舌病相似或常见的羊传染病的阳性血清，判断是否存在交叉反应，检验其特异性。

1.8 敏感性试验将阳性血清从160倍开始进行倍比稀释，用建立的间接ELISA方法进行检测，将能检出阳性的稀释倍数确定为检测限。

1.9 重复性试验从同一时间包被的3块酶标板中分别取出2条，从不同时间包被的3块酶标板中分别取出2条，组成一整板，检测已知6份阴性血清、1份阳性血清和1份免疫血清，根据公式：变异系数=标准差/D450 nm平均值，计算每个样品的批内变异系数和批间变异系数。

1.10 鉴别检测试剂盒的初步应用用鉴别检测试剂盒对深圳口岸不同时间段截获的境外绵羊血清80份、国内收集的未知绵羊血清80份以及20份灭活疫苗免疫血清进行检测。同时，用商品化的蓝舌病ELISA抗体检测试剂盒(美国IDEXX)对这些样品进行对比检测，并对两者的检测结果进行比较。

2 结果

2.1 BTV NS3原核表达载体的构建通过菌落PCR、双酶切和测序鉴定构建的BTV NS3原核表达载体。菌落PCR和双酶切(BamHⅠ+EcoRⅠ)均能得到与预期大小一致(702 bp)的目的片段(图1)，同时经测序确认正确插入且无碱基突变，说明原核表达载体pETDuet-NS3构建成功。

图1 重组表达载体pCold-NS3双酶切扩增片段 1.菌落PCR结果;2.双酶切结果;M.DNA Marker

2.2 重组蛋白NS3的表达与纯化将含重组表达质粒pETDuet-NS3的表达菌接种至自诱导表达培养基Overnight ExpressTMInstant LB Media进行过夜诱导表达，并使用Ni-NTA Fast Start Kit(6)试剂盒纯化原核表达的NS3蛋白。通过SDS-PAGE、Western blot分析，结果显示该重组蛋白能被BTV阳性血清识别，说明纯化的重组蛋白NS3抗原性良好(图2,3)。

2.3 间接ELISA条件的确定通过棋盘滴定法确定，当包被抗原质量浓度为0.25 mg/L，待检血清160倍稀释时，阳性血清D450值(P值)/阴性血清D450值(N值)较大，该组合为最佳包被质量浓度和待检样品的稀释倍数。其他反应条件见表1。

图2 NS3蛋白的表达与纯化 1.纯化的NS3蛋白;2.诱导表达后pETDuet-NS3表达菌总蛋白;3.空载体对照;M.蛋白Marker

图3 Western blot结果 M.蛋白Marker;1.空载体对照;2.诱导表达后表达菌总蛋白;3.纯化的NS3蛋白

表1 间接ELISA反应条件

2.5 特异性试验用建立的ELISA方法对羊口蹄疫、水泡性口炎、羊痘、小反刍兽疫阳性血清进行检测，结果显示，4种病毒阳性血清的D450 nm值均<0.209，均为阴性(图4)，表明该方法具有良好的特异性。

图4 特异性试验结果 FMDV.口蹄疫病毒；VSV.水泡性口炎病毒；SPV.羊痘病毒；PPRV.小反刍兽疫病毒

2.6 敏感性试验用建立的ELISA方法对倍比稀释的BTV阳性血清进行检测，结果如图5所示，当阳性血清稀释1 280倍时，D450 nm值仍大于临界值0.220，说明建立的ELISA方法具有较好的灵敏度。

图5 敏感性试验结果

2.7 重复性试验通过检测BTV已知阴性血清、阳性血清和免疫血清，计算8份样品的批内重复试验变异系数为3.28%～7.29%，批间变异系数为2.33%～9.24%，批内、批间变异系数均小于10%，表明检测结果具有良好重复性(表2)。

2.8 鉴别检测试剂盒的初步应用用建立的鉴别检测试剂盒和IDEXX ELISA试剂盒同时检测绵羊血清样品，结果显示2种试剂盒检测国内收集的未知绵羊血清结果一致，均为75份阴性，5份阳性，符合率100%；20份已知免疫血清，鉴别检测试剂盒检测结果D450值均小于0.22，均为阴性，而IDEXX ELISA试剂盒检测结果均为阳性；深圳口岸截获的境外绵羊血清，鉴别检测试剂盒检测结果均为阴性，IDEXX ELISA试剂盒检测发现有72份阴性，8份阳性(表3)。

表2 ELISA重复性试验结果 D450 nm

表3 鉴别检测试剂盒与IDEXX ELISA试剂盒

3 讨论

疫苗接种仍是目前防控BTV的重要手段。商品化的BTV疫苗目前主要包括弱毒疫苗与灭活疫苗2类，相对于BTV的多价弱毒疫苗可能导致的病毒基因重组和毒力的增强，灭活疫苗的安全性更高。我国在蓝舌病疫苗方面也取得了诸多进展，DNA疫苗、重组痘病毒载体疫苗和重组腺病毒疫苗等均能产生中和抗体,对动物有一定的免疫保护作用[9-10]。云南畜牧兽医科学院研制的BTV-1型灭活疫苗具有良好的免疫效果[11-12]。在开发疫苗的同时，建立一种可鉴别BTV自然感染与疫苗接种的检测方法，对防控新型蓝舌病传入和净化国内养殖环境具有重要意义。但是，目前国内尚未有鉴别检测BTV自然感染与疫苗接种的抗体检测试剂盒。

作为一种非结构蛋白，NS3蛋白的氨基酸序列高度保守，并且只在被BTV感染的细胞中存在，因此是很好的鉴别诊断试剂盒的靶蛋白。本试验以BTV-8 S10序列为模板，根据大肠杆菌密码子偏好性进一步优化基因序列，构建了原核表达重组载体pETDuet-NS3。同时，在诱导表达过程中，本试验采用自动诱导表达培养基Overnight ExpressTMInstant LB Media，该培养基无需监测细菌生长状态、无需添加IPTG等诱导剂即可高水平自动诱导目的蛋白的表达，从而大幅提高了NS3蛋白的表达量。

本试验以纯化的NS3重组蛋白作为包被抗原，通过一系列的条件优化，建立并组装了鉴别蓝舌病自然感染和免疫接种的间接ELISA检测试剂盒。在验证的过程中，本试验发现鉴别检测试剂盒可检测出BTV-1型、8型和16型自然感染的阳性血清，这一结果进一步证实了NS3蛋白氨基酸序列高度保守性和群特异性。同时，由于没有商品化的鉴别检测试剂盒可比较，本试验以IDEXX公司的BTV抗体ELISA试剂盒进行对比检测，两者的80份国内收集的绵羊血清检测结果符合率为100%，其中5份2种试剂盒检测结果均为阳性的绵羊血清初步确定为野毒自然感染，这一结果与目前我国蓝舌病的流行情况和灭活疫苗尚未推广使用的现状相吻合。而鉴别检测试剂盒对口岸截获的境外绵羊血清的检测结果全部阴性，与IDEXX试剂盒的检测结果存在差异。8份IDEXX试剂盒的检测结果为阳性而鉴别检测试剂盒检测结果为阴性的境外血清均来自于欧洲，因此推测极可能为灭活疫苗接种绵羊的血清，这一结果进一步确证了本试验研制的间接ELISA检测方法可鉴别BTV自然感染与疫苗接种。本试验研制的间接ELISA鉴别检测试剂盒经特异性、敏感性、重复性及应用试验分析，具有较好的检测能力，可初步应用于BTV血清抗体的鉴别检测。