碘油与葡聚糖微球栓塞兔肝VX2移植瘤疗效对比

谷铁树，李 博，吴勇超，郝晓光，史 博，李智岗

(河北医科大学第四医院放射科，河北 石家庄 050011)

肝细胞癌是常见的恶性肿瘤,发病率、病死率极高，但由于其发病隐匿，多数患者明确诊断时已经是肿瘤中晚期,手术切除的机会少，术后复发常见。经肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)作为中晚期肝脏恶性肿瘤的首选治疗方法[1]，已在世界范围内获得广泛认可，而栓塞剂是肝癌介入疗效最主要的影响因素。碘油虽然很早就在介入治疗中获得应用，但治疗结果尚存争议，有学者认为其存在容易形成侧支循环、损伤正常肝质及毒性等缺陷[2]；葡聚糖微球已广泛应用于肝脏恶性肿瘤、肾脏恶性肿瘤、肾上腺肿瘤、肺肿瘤、子宫良恶性肿瘤等实体肿瘤的介入治疗中,可对末梢微动脉形成可靠栓塞，不可吸收、无毒性、抗原性，已获得很好的疗效。本研究通过对比上述2种栓塞材料栓塞兔VX2肝移植瘤前后的CT灌注参数及免疫组织化学结果，比较2种材料的治疗结果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1荷瘤兔制备 新西兰大白兔50只(补实验动物的实验室和编号)，雌雄不限，于肝脏接种VX2瘤株细胞制备的浓度为1×105/mL的悬液。种植后14 d行CT灌注增强扫描确认种植成功[3]。

1.2分组 制备成功的肝肿瘤兔50只随机分为2组，每组25只。进行肝脏肿瘤栓塞对照研究。

1.3CT灌注扫描及图像后处理 将荷瘤兔全身麻醉后固定，经兔耳缘静脉以团注法注入碘对比剂，对荷瘤兔肝脏行三期动态灌注扫描，应用肝肿瘤灌注模块对数据后处理，将荷瘤兔的腹主动脉与肝脏门静脉分别设为流入的动脉与流入的静脉，把肿瘤明显强化区域与其周围肝实质设成兴趣区，获得荷瘤兔肝脏肿瘤与正常肝脏实质时间-密度曲线(time-density curve,TDC)和伪彩图像，同时获得肿瘤组织和周边正常肝组织CT灌注的参数[4-6]。

1.4栓塞治疗 扫描后次日，将荷瘤兔随机分组，以1%利多卡因经耳缘静脉全身麻醉荷瘤兔后仰卧固定于实验台，于兔右下肢股动脉搏动最明显处切开皮肤肌层并分离暴露股动脉，结扎股动脉远端，穿刺股动脉并留置穿刺针鞘管，随后经穿刺鞘管用微导管先后行荷瘤兔腹腔动脉及肝固有动脉造影，确定肿瘤供血动脉走行、肿瘤位置及肿瘤大小，分别以碘油及葡聚糖微球对荷瘤兔肝肿瘤行超选择行动脉栓塞。术后予荷瘤兔每日庆大霉素4万U肌内注射，连续3 d，预防感染。

1.5栓塞治疗后处理 栓塞治疗后14 d对2组荷瘤兔行再次CT灌注扫描。扫描方法同1.1。扫描后处死荷瘤兔，分离完整肝脏肿瘤组织(包括肿瘤周围的正常肝质)进行抗CD34及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)免疫组织化学染色。

1.6观察参数

1.6.1CT灌注扫描参数 组织血流量(blood flow,BF)、组织血容量(blood volume,BV)、肝动脉供血分数(hepatic arterial fraction,HAF)、肝动脉灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)及门静脉灌注量(portal vein perfusion,PVP)，肝动脉灌注指数(hepatic arterial index，HPI)及门静脉灌注指数(portal venous perfusion index,PPI)。

1.6.2免疫组织化学染色法 通过采用过氧化物酶标记的联酶卵白素染色法获得肝脏肿瘤切片的VEGF与CD34染色阳性的微血管密度(microvascular density，MVD)结果。

1.7统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1荷瘤兔的CT灌注参数结果 进行栓塞治疗前2组荷瘤兔的肝脏肿瘤CT灌注参数BF、BV、HAF、HAP、PVP之间，差异无统计学意义(P>0.05);而进行栓塞治疗后碘油组BF、BV、HAF、HAP均大于葡聚糖微球组，碘油组PVP小于葡聚糖微球组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 CT灌注参数对比Table 1 Comparison of CT perfusion parameters

2.2免疫组织化学结果 对2组荷瘤兔栓塞后的肝脏肿瘤组织标本进行免疫组化染色，结果显示在荷瘤兔肝肿瘤周边正常肝组织内未见或仅见少量VEGF和CD34染色，而荷瘤兔肝脏肿瘤组织标本活性区域内免疫组织化学染色后VEGF和CD34的表达量，葡聚糖微球组较碘油组表达少，2组间的MVD差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1～4，表2。

Figure 1 The expression of CD34 in dextran microspheres group(SP ×200)

表2 免疫组织化学CD34、VEGF的MVD 比较Table 2 MVD comparison of CD34 and VEGF by immunohistochemistry

3 讨 论

目前肝癌的介入栓塞治疗仍然是不能手术的中晚期肝癌首选治疗方法[1]。经动脉化疗栓塞治疗的主要效果来自于肝动脉栓塞，碘油是目前临床上广泛使用的栓塞剂之一，已获得良好的效果。近年来，各种材料的微球类栓塞剂先后面试，在临床上广泛应用，也取得了很好的治疗效果，获得了部分专家的认可。而微球类栓塞剂是否具有与碘油一样或者更佳的栓塞效果，仍是专家学者讨论的热点[7]。葡聚糖是一种天然非动物来源的多糖分子，易于化学修饰，可通过化学方式制备成球状的葡聚糖颗粒，它很难溶解于水，不溶解于酒精、乙醚等有机溶剂，能均匀地栓塞微小动脉，是一种较理想的长效末梢动脉栓塞剂，已较多应用在临床肿瘤介入治疗中。本研究试图通过对2种栓塞材料栓塞前后兔肝移植瘤CT灌注参数的变化及免疫组织化学结果的统计学分析，对比2种栓塞材料的栓塞效果。

3.1CT灌注参数的比较 CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)可定量分析肿瘤区域血液供应情况，已经在临床上普遍用来评价肝癌介入栓塞治疗的效果。李珊玫等[8]、刘璐璐等[9]研究显示CT灌注成像可以量化评价肝脏肿瘤的血流灌注状态，对肝癌介入治疗方案的选择及术后栓塞效果的评价具有重要意义。本实验统计学分析结果表明，虽然栓塞后荷瘤兔肝肿瘤内仍然存在血流灌注，但葡聚糖微球组肿瘤内的血液流量及肝动脉灌注流量均低于碘油组，而荷瘤兔肝脏门静脉的灌注量高于碘油组。这说明应用葡聚糖微球栓塞肿瘤供血动脉比应用碘油栓塞对荷瘤兔肝脏肿瘤的血液供应效果更加确切，而对门脉灌流量影响较碘油小。有临床研究表明，使用碘油栓塞后肿瘤供血动脉后，肝癌周围容易有侧支循环建立，分析原因可能为化疗药物与油碘混悬时碘油颗粒大小不一，直径较大碘油液滴无法进入周围小动脉行末梢栓塞，后期血流冲刷导致部分血管再通，同时较碘油小液滴可通过肝血窦进入门静脉栓塞周围正常肝组织，造成门静脉灌注减少。葡聚糖微球表面带有相同微电荷，球体相互排斥，不宜凝集成较大集团引起沉淀[10]，因此可于碘对比剂与盐水以特定比例形成的混合液中悬浮，这可以使得微球在进行肿瘤供血动脉栓塞的过程中，不会因为微球间相互聚集形成沉淀，在栓塞过程中造成微导管阻塞；肝脏血窦直径7～12 μm，毛细血管前终末微动脉内径<50 μm，葡聚糖微球直径50～500 μm，可以栓塞100 μm左右的微动脉，有效阻止肿瘤周围动脉与肿瘤供血动脉建立侧支循环的同时，却无法通过终末微动脉及肝血窦进入门静脉，栓塞周围正常肝组织，可以更加有效地避免肿瘤患者肝脏功能的损伤以及栓塞治疗术后各种介入并发症的发生[11]。

3.22组间的免疫组织化学参数比较 临床研究表明，肿瘤的生长、复发及转移与肿瘤血管的生成密切相关，因此肿瘤的新生血管的情况决定了介入栓塞的效果[12-13]。林继宗等[14]研究表明肿瘤供血动脉栓塞2 d以内，碘油在肿瘤组织内沉积覆盖范围最大，动脉闭塞最完全；7 d以后肿瘤组织内的VEGF表达开始出现上调，并随着时间的延长逐渐升高，在术后21 d达到峰值；术后7～14 d肿瘤组织内微血管开始形成，术后21 d有小动脉血管出现，28 d有明显新血管的生成。肿瘤的血管形成是一个极其复杂的过程，包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环及形成新的基底膜等步骤。在整个肿瘤血管形成期间，肿瘤细胞与血管内皮细胞之间通过分泌细胞刺激因子互相影响，参与并促进血管形成的因子种类众多，其中VEGF是一种高度特异性的促血管内皮生长因子，在肿瘤血管形成过程中发挥最重要的作用，可促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等，尤其是在低氧状态下，其作用更加明显[15]。CD34是一种重糖化I型跨膜蛋白，属于唾液黏液蛋白家族成员，在各种血管源性肿瘤剂多种肿瘤间质中小血管的表达已经得到证实，可引起血管内皮细胞的迁移。因而，VEGF与CD34是提示新生肿瘤血管的重要指标。MVD值是一种较直观地反映肿瘤新生血管增生情况的方法，可作为评价肿瘤血管生成程度的客观标准，目前已获得国内外学者公认。有研究表明，TACE术后阻断了肝肿瘤的供血动脉，残留肿瘤组织在低氧状态下，可通过多种机制上调促血管生成因子的表达，促进肝肿瘤血管的形成，与周围建立侧支循环[16]。本次实验通过测定2种栓塞剂栓塞荷瘤兔后肝脏肿瘤组织的VEGF与CD34表达的MVD值，显示葡聚糖微球组栓塞后荷瘤兔肝脏肿瘤组织的VEGF与CD34的MVD表达平均值均比碘油组低。这说明栓塞治疗后前者的肝脏肿瘤新生供血血管数量较后者的少，证明前者的栓塞效果更佳。徐强等[17]在介入治疗子宫肌瘤时表明，葡聚糖微球可在生理盐水和等量的含碘造影剂混合液中稳定悬浮，在子宫动脉栓塞的过程不易阻塞微导管，更易进入远端的微动脉，从而更好抵御动脉血流的冲刷，在末梢的微小动脉形成稳固的栓塞，阻断肿瘤的血液供应。葡聚糖微球的这种特性在本次对荷瘤兔肝肿瘤栓塞实验中表现地非常明显，栓塞后荷瘤兔肝肿瘤组织的免疫组织化学VEGF及CD34的MVD表达平均值均比碘油组低。

通过本次应用2种不同栓塞剂栓塞荷瘤兔肝脏肿瘤的实验研究，对获得的实验数据进行对比分析结果显示，应用葡聚糖微球栓塞荷瘤兔肝脏肿瘤供血动脉后，对血流的阻断效果要优于碘油，栓塞后不易形成侧支循环，同时栓塞对肿瘤周围正常肝脏组织影响小，并且葡聚糖微球无抗原性及毒性，避免了因碘油毒性对肝功能的损害导致的碘油用量限制。由于篇幅所限，本次实验未对2种栓塞剂对肝功能损伤情况进行研究，将在以后实验中完善。