鱼新鲜度对其烤鱼片中晚期糖基化终末产物形成的影响

刘秀英,朱泓颖,李学鹏,高 雪,汤轶伟,励建荣,朱力杰

(渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心(大连工业大学和渤海大学),辽宁锦州 121013)

烤鱼片是一类深受我国消费者喜爱的传统休闲调理食品,富含蛋白质等人体必需的营养成分,具有良好的风味与口感。鱼肉一般需要在50 ℃左右初烘一段时间以脱去大部分水分,再经200 ℃以上的短时高温烘烤制成烤鱼片[1]。这些加热工艺使鱼肉中的各组分(主要是蛋白质和糖等)间发生了美拉德反应,形成令人愉悦的金黄色外观与烤鱼片特有的风味,但伴随这一过程产生的晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end-products,AGEs)不容忽视。AGEs是一类由还原糖同蛋白质、脂质、核酸等生物大分子发生非酶型美拉德反应,醛基经过缩合、重排、裂解以及氧化修饰后,产生的多种稳定终末产物的总称[2]。大量研究表明,尽管部分AGEs可以在体内代谢,但摄入过多富含AGEs的食品并在体内积蓄到一定程度后,会逐渐发生不易察觉的病理性转变[3]。AGEs不仅能够对机体直接带来影响,还可以与特异性受体结合进而改变细胞和蛋白质功能,进而引发糖尿病及其并发症、阿尔茨海默症、心血管及肾脏疾病等多种慢性疾病[4-7]。食品的烹饪和热加工过程中会产生AGEs已经是一个公认的事实。在已知AGEs当中,常被检出的单体化合物有羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyl lysine,CML)、羧乙基赖氨酸(Nε-carboxyethyl lysine,CEL)、吡咯素(pyrraline)、戊糖素(pentosidine)等[8]。

鱼新鲜度是评价鱼肉食用品质和加工性能的重要指标。由于鱼肉普遍具有较高的水分活度和蛋白质含量,在鱼死后,鱼体内微生物酶和自溶酶的作用能使蛋白质等物质发生降解,发生脂肪氧化酸败等一系列化学和物理变化[9-10]。随着蛋白质等生物大分子在各种酶的作用下发生水解,会暴露出更多的含氨基酸侧链、游离氨基酸、核苷酸等糖基化反应的活性位点。对于烤鱼片类产品来说,新鲜度较低的鱼肉进行高温干制过程中,二羰基化合物有了更多的结合目标物,成品中AGEs的含量较新鲜鱼肉的制品有增加的可能。Niu等发现,新鲜鲶鱼肉在0 ℃贮藏21 d后,于100 ℃下加热5 min,结合态CML含量提升了107%,至30 min时更是达到了172%[11]。尽管该研究涉及的加热工艺与常规烤鱼片不同,但也在一定程度上说明鱼新鲜度能够影响其加热制品中AGEs含量。此外,Tavares等则发现,带鱼在220 ℃下烘烤20～30 min,CML含量由未检出提升至每100 g蛋白质3 mg左右[12]。目前在烤鱼片加工过程中,主要关注的是鱼肉新鲜度对产品感官品质的影响[13],缺乏在这一过程中形成有害产物的分析,因此研究鱼新鲜度对烤鱼片中AGEs含量的影响具有重要意义。

鉴于此,本研究选取马面鱼(Thamnaconusmodestus)这一传统烤鱼片加工用鱼制作烤鱼片,以挥发性盐基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)评定原料鱼肉的新鲜度,考察鱼肉中的游离氨基酸、核苷酸、脂肪氧化产物等与AGEs形成相关的主要组分在新鲜度降低过程中发生的变化,分析鱼肉新鲜度对烤鱼片成品中总AGEs、荧光型AGEs、戊糖素及CML含量的影响,探索实际加工过程中烤鱼片AGEs的形成规律。本文不仅可以为烤鱼片中AGEs等食品加工过程中有害物的成因提供理论支撑,还能够为后续研究调控高温干制类型水产品中AGEs含量的方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻马面鱼 购自当地水产批发市场,解冻后初始TVB-N值小于7 mg/100 g;总AGEs和CML含量测定试剂盒 购自南京建成生物工程研究所有限公司;氨基酸标准品(99%) 购自美国Sigma-Aldrich公司;甲醇 色谱纯,购自美国Thermo Fisher公司;磺基水杨酸、乙酸钠、磷酸氢二钠等试剂 均为国产分析纯。

970CRT型荧光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;L-8900型氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司;UV-2550型紫外分光光度计 日本Shimadzu公司;Victor X3型多功能酶标仪 德国Perkin-Elmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 烤鱼片的加工 马面鱼解冻→切片→漂洗→干燥→揭片→回潮→烘烤→轧片和整形→成品

关键操作点:原料鱼去皮去骨后,使用绞肉机打碎,将碎鱼肉称量好后备用,其余原料于4 ℃下贮藏;成型的鱼片放入烘箱后,45 ℃下烘3.5 h;烘好后的鱼片放入烤箱中,上下火250 ℃,烘烤5 min,烤至表面金黄色;烤好的鱼片冷却至室温,随后进行轧片和整形。

1.2.2 不同新鲜度原料制备烤鱼片 处理好的鱼肉置于4 ℃下贮藏,分别放置1、2、3、4、5、6、7 d后在1.2.1条件下制成烤鱼片。分别取不同贮藏时间下生鱼肉及其制成的烤鱼片样品,测定全部样品游离氨基酸、核苷酸、乙二醛含量,生鱼肉样品中的TVB-N含量,烤鱼片样品中的总AGEs、CML、荧光性AGEs及戊糖素的含量变化并进行分析。

1.2.3 TVB-N含量的测定 参考国标中微量扩散法测定[14],马面鱼解冻后于4 ℃下分别放置1、2、3、4、5、6、7 d。鱼体去头、去骨、去皮,搅碎鱼肉,取20 g试样置于具塞锥形瓶中,准确加入100 mL蒸馏水,振荡,浸渍30 min后过滤。将水溶性胶涂于扩散皿的边缘,在皿中央内室加入20 g/L硼酸溶液1 mL 及1滴混合指示剂(甲基红乙醇溶液与溴甲酚绿乙醇溶液比例为1∶5)。在皿外室准确加入滤液1.0 mL,盖上磨砂玻璃盖,从缝隙处快速加入1 mL饱和碳酸钾溶液,立刻平推磨砂玻璃盖,将扩散皿盖严密,以圆周运动方式轻轻转动,使样液和饱和碳酸钾溶液充分混合,随后于(37±1) ℃恒温箱内放置2 h,放凉至室温,揭去盖,用盐酸标准滴定溶液(0.01 mol/L)滴定,终点颜色至紫红色。

试样中TVB-N含量计算:

式中,X为试样中TVB-N的含量(mg/100 g);V1为试液消耗盐酸标准滴定溶液的体积(mL);V2为试剂空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积(mL);c为盐酸标准滴定溶液的浓度(mol/L);14为滴定1.0 mL盐酸(1 mol/L)标准滴定溶液相当于氮的质量(g/mol);m为试样质量(g);V为准确吸取的滤液体积(1 mL);V0为样液总体积(100 mL);100为计算结果换算为mg/100 g的换算系数。

1.2.4 游离氨基酸的测定 参考衣美艳等的方法测定鱼肉中游离氨基酸的含量[15],称取研磨过的鱼肉样品1.2 g置于50 mL塑料水解管中,加入15 mL 10%磺基水杨酸匀浆,静置2 h,冷冻离心(10000 r/min,15 min),取上清液5 mL,0.1 mol/L NaOH调节pH至2.2,纯净水定容至10 mL,随后经0.45 μm滤膜过滤,置于进样瓶中待测。将混合氨基酸标准工作液注入氨基酸自动分析仪,色谱柱为磺酸型阳离子树脂,检测波长为570和440 nm。混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪,以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。

1.2.5 核苷酸的测定 采用高效液相色谱法测定鱼肉中核苷酸的含量[16],称取鱼肉样品5 g并加入15 mL 75%甲醇进行研磨,离心(8000 r/min,10 min),吸出上清液后沉淀部分再用10 mL 75%甲醇处理2次,合并上清液,用0.1 mol/L KOH调pH至6.5,于4 ℃静置至所有沉淀析出,过滤后取上清定容至50 mL,随后经0.22 μm滤膜过滤,置于进样瓶中待测。整个操作过程于冰浴条件下完成。高效液相色谱检测条件为:AQ18型色谱柱,30 ℃柱温,进样量10 μL,流速1 mL/min,流动相:缓冲液(1.4 mmol/L四丁基硫酸氢铵,0.01 mol/L磷酸二氢钾)∶甲醇=1000∶40 (V/V),检测时间33 min,紫外检测波长260 nm。

1.2.6 乙二醛的测定 采用分光光度法测定鱼肉样品中乙二醛的含量[17]。将40%乙二醛溶液梯度稀释,随后向各浓度乙二醛溶液(0.05 mL)中加入15 g/L乙酸钠溶液(0.5 mL)、2 g/L盐酸羟胺溶液(1 mL),50 ℃水浴加热20 min,冷却后用0.2 mol/L PBS(pH8.0)定容至25 mL,PBS调零后测量233 nm处吸光度值,绘制乙二醛标准曲线y=1.84163x-0.09748,R2=0.99731。称取鱼肉0.05 g放入研钵,同样加入15 g/L乙酸钠溶液(0.5 mL)、2 g/L盐酸羟胺溶液(1 mL)进行研磨至均匀泥状,并经上述环节进行显色反应,测量233 nm处吸光度值,随后根据标准曲线计算乙二醛含量。

1.2.7 总AGEs和CML的测定 基于酶联免疫法,按照试剂盒说明书对烤鱼片中总AGEs和CML的含量进行检测,试剂盒使用前在室温平衡30 min。烤鱼片按重量体积比1∶9 g/mL的比例加入磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH7.4),充分匀浆,于3000 r/min离心20 min,收集上清液待测。采用多功能酶标仪对样品进行分析,设置空白孔、标准品孔、样品孔,加入准备好的样品和标准品、生物素抗原,在37 ℃下反应30 min。洗板5次,加入亲和素-HRP,在37 ℃下反应30 min。洗板5次,加入显色液A、B,37 ℃避光显色10 min。加入终止液50 μL。以空白孔调零,在加终止液后10 min内,于450 nm波长下依序测量各孔的吸光度值(OD值)。

1.2.8 荧光性AGEs及戊糖素含量的测定 称取5 g搅碎后的烤鱼片,分别加入20 mL 1.6 mol/L的NaCl溶液,25 mL 0.2 mol/L PBS缓冲液(pH6.7),于10000 r/min高速剪切1 min,静置60 min,随后经两层纱布过滤[18]。取滤液0.1 mL于试管中,加入0.2 mol/L PBS缓冲液 pH8.0稀释30倍,经0.22 μm滤膜过滤;在激发波长370 nm,发射波长360～382 nm处测定荧光性AGEs的荧光强度[19];在激发波长335 nm,发射波长359～500 nm处测定戊糖素的荧光强度。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,数据采用SPSS 16.0软件进行分析,采用Origin 2018b软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 鱼肉中TVB-N的含量变化

TVB-N能够反映出鱼死亡后体内二甲胺、三甲胺等挥发性含氮成分的变化趋势,是评价鱼肉新鲜度的重要指标[20],国标规定优级品和合格品的鲜海水鱼中TVB-N含量分别要小于/等于15和30 mg/100 g[21],故TVB-N含量大于30 mg/100 g则视为不新鲜的海水鱼。用于加工烤鱼片的马面鱼解冻后,在4 ℃下冷藏保存过程中,随着时间的延长,鱼肉中TVB-N的含量不断增加(图1),至7 d时均值达34.28 mg/100 g,超过了新鲜鱼肉的标准。故从加工制品的安全性出发,本研究主要考察7 d内鱼新鲜度的降低对鱼肉中与AGEs产生密切相关的各组分及最终AGEs产生量的影响。

图1 鱼肉中TVB-N随时间的变化

2.2 鱼肉及烤鱼片中游离氨基酸的含量变化

目前食品中发现的氨基酸衍生类AGEs中,大多数与赖氨酸、精氨酸等的残基糖基化有关[22],其中赖氨酸侧链中的两个氨基是蛋白质中最具糖基化反应活性的前体胺类物质[23],其含量同CML、CEL等典型AGEs的产生量密切相关。而精氨酸的胍基侧链同样是二羰基化合物糖基化的作用位点,尤其是与丙酮醛形成的三种氢咪唑酮类AGEs衍生物在食品中较为常见[24]。此外,组氨酸的咪唑侧链等也常参与到蛋白质的糖基化与氧化过程中[25],赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和天冬氨酸还能够形成类黑素类糖基化产物26]。尽管其他游离氨基酸的存在也可能对AGEs的含量产生影响,但以上述6种氨基酸最为典型。游离氨基酸结果表明,随着生鱼肉贮藏时间的延长,6种和AGEs产生密切相关的氨基酸含量均出现了不同程度的增长(图2A),这主要同鱼肉中的蛋白质在酶的作用下发生了部分水解有关。赖氨酸的含量在4和5 d间均值从0.657 mg/100 g增大至1.264 mg/100 g,涨幅近一倍。这些结果表明5 d后生鱼肉中AGEs的前体物质存在进一步增加的趋势。烤鱼片中的游离氨基酸含量总体变化趋势同生鱼肉中相似,在5 d及以后大多数氨基酸的含量都出现了一定的增长(图2B)。

图2 鱼肉(A)及烤鱼片(B)中游离氨基酸含量随时间的变化

2.3 鱼肉及烤鱼片中核苷酸的含量变化

核苷酸中的鸟苷基部分与二羰基化合物具有很强的结合能力,在各类DNA碱基当中,鸟嘌呤最易同乙二醛及丙酮醛发生作用并形成糖基化产物,但目前关于由DNA衍生的核苷酸型AGEs形成的研究还比较有限[27]。核苷酸检测结果表明,生鱼肉和烤鱼片中的鸟嘌呤核苷酸含量均同鱼肉的贮藏时间呈正相关(图3),表明随着新鲜度的降低,更多的核苷酸从鱼肉中释放出来,也就有了更多能够产生核苷酸型AGEs的前体物质。

图3 鱼肉(A)及烤鱼片(B)中核苷酸含量随时间的变化

次黄嘌呤是腺嘌呤脱去一个氨基的产物,可以经由体内氧化酶的作用氧化生成尿酸,并在这一过程中产生羟基自由基,加速AGEs的形成[28]。值得注意的是,次黄嘌呤核苷酸虽然在各组生鱼肉样品中均未检出,但烤鱼片中不仅含有一定量的次黄嘌呤核苷酸,且在6～7 d处从193.61 mg/100 g增大至385.53 mg/100 g。这可能是由于腺嘌呤核苷酸对烤鱼片的干燥、烘烤等工艺环节较为敏感,而随着新鲜度逐渐降低,游离腺嘌呤核苷酸含量增加,导致产生了更多的次黄嘌呤核苷酸。

2.4 鱼肉及烤鱼片中乙二醛的含量变化

乙二醛是糖基化反应过程中的早中期产物,是一种由Amadori产物经一系列复杂、缓慢的脱氢、氧化和重排等反应产生羰基化合物,具有高度的活性,同产生AGEs的含量密切相关[3,19]。由图4可知,生鱼肉中乙二醛的含量随时间的变化并不明显,但烤鱼片中乙二醛的含量随着贮藏时间的延长而增大,至7 d时已达0.13 mg/g,较初始含量增加26.55%。采用Pearson相关系数分析不同贮藏时间下烤鱼片中乙二醛含量与新鲜度之间的相关性,得出乙二醛含量与新鲜度的变化呈负相关(|r|>0.8),相关系数为0.882。这一结果说明尽管新鲜度的下降并不能够直接影响鱼肉中乙二醛的含量,但可能随时间的推移逐渐积累了更多席夫碱乃至Amadori产物,而烤鱼片的加工过程显然促进了这一二羰基化合物的形成,最终导致含量的增加。

图4 鱼肉及烤鱼片中乙二醛含量随时间的变化

2.5 烤鱼片中总AGEs和CML的含量变化

总AGEs及CML含量采用酶联免疫法检测,其结果主要反映的是烤鱼片样品中非蛋白质结合型AGEs及游离态CML的含量。不同贮藏时间下烤鱼片中总AGEs与CML含量变化结果见图5。总AGEs的含量随着时间的变化逐渐上升(图5A),各组间的结果具有显著性差异(P<0.05),至7 d时达7.24 μg/g烤鱼片,约为初始值的1.7倍,说明鱼肉新鲜度的降低显著提升了烤鱼片中AGEs的含量水平,这一结果同鱼肉中氨基酸、核苷酸及脂肪氧化产物的含量变化结果相似。采用Pearson相关系数分析烤鱼片中总AGEs含量与新鲜度的相关性,得出总AGEs含量与新鲜度的变化呈负相关(|r|>0.8),相关系数为0.909。在已知AGEs当中,CML是从生物体内的糖化蛋白中分离检测到第一个AGEs单体化合物。由于与食品中AGEs总量具有一定的相关性,CML常被作为AGEs的检测标志物[29]。鱼肉中的Amadori产物在氧化降解后形成乙二醛等早中期糖基化产物,随后与多种胺类物质进一步反应生成CML等终产物。图5B中CML随时间的变化趋势同总AGEs类似,从1 d时的1.63 μg/g增加到7 d时的4.01 μg/g,与新鲜度的变化亦呈负相关(|r|>0.8),相关系数为0.948。放置至2 d的鱼肉制成的烤鱼片中游离态CML的含量(2.20 μg/g)已经超过核桃粉(1.92 μg/g)的水平,至5 d时(3.17 μg/g)则超过了莲子羹粉(2.95 μg/g),至7 d时更是超过了豆浆粉(3.56 μg/g)[30]。这些粉状产品往往经大量水冲调后饮用,其游离态CML最终含量一般小于0.5 μg/mL食品,但对于直接食用的烤鱼片类产品来说,相对较高的CML含量意味着更高的总AGEs摄入水平,安全风险也更大。

图5 鱼肉经不同贮藏时间制成的烤鱼片中 总AGEs(A)与CML(B)的含量变化

2.6 烤鱼片中荧光性AGEs及戊糖素的含量变化

AGEs总体上可以分为无荧光性产物与有荧光性产物,两类物质的反应途径及结构均存在较大差异,因此酶联免疫法并不能够完整地反映出样品中AGEs的含量[19]。而具有自发荧光性AGEs产物,可以通过测定其荧光强度来反映AGEs水平。荧光性AGEs主要是氨基酸之间的交联产物,其中以戊糖与精氨酸、赖氨酸发生交联反应形成的戊糖素最为典型。戊糖素的含量亦可用于评估糖基化过程造成的蛋白质损伤情况。本研究基于部分AGEs具有特有荧光,且特征光谱各不相同的特点,进一步检测了烤鱼片中荧光性AGEs及戊糖素的荧光强度随时间变化的情况。结果表明,荧光性AGEs(图6A)和戊糖素(图6B)的荧光强度均随时间的推移而增大,说明新鲜度较低的鱼肉制成的烤鱼片中荧光性AGEs含量更多,这与总AGEs及CML含量的变化趋势相近。

图6 鱼肉经不同贮藏时间制成的烤鱼片中荧光性AGEs(A)与戊糖素(B)的荧光强度变化

3 讨论

本研究选取的马面鱼肉在4 ℃冷藏的过程中,于7 d内经历了由新鲜到不新鲜的变化过程。随着鱼新鲜度的降低,大量游离氨基酸及核苷酸被释放出来,提供了更多的糖基化反应位点,加之鱼肉中本身含有一定量的还原糖[31],具备了形成更多二羰基化合物乃至AGEs的可能性。但由于Amadori重排反应在低温或常温下是一个缓慢而复杂的反应,因此生鱼肉中乙二醛含量并未随时间的推移出现明显上升;当鱼肉经干燥、烘烤等热加工工艺处理后,加快了上述反应进程,烤鱼片中乙二醛含量与鱼肉的新鲜度也表现出了对应关系。而烤鱼片中总AGEs、荧光性AGEs、CML及戊糖素的含量均随时间推移而增加,也同早中期糖基化产物乙二醛的含量变化相互印证。综合本研究的各项实验结果,在1～7 d贮藏过程中随着时间的推移,TVB-N值上升、鱼新鲜度逐渐降低,相应地游离氨基酸及核苷酸的含量呈升高趋势,这一变化同烤鱼片中乙二醛及AGEs含量增大的趋势具有正相关性。说明新鲜度较低的鱼肉加工制成烤鱼片后,其AGEs含量要高于相同工艺的新鲜鱼肉制品。从形成各AGEs指标的总体情况来看,4 ℃冷藏3 d内加工制成的马面鱼烤鱼片较为适宜食用。此外,鱼肉中各项指标的测定均以湿重计,而经烤制后水分含量会大幅度下降,故无法将生鱼肉同烤鱼片中各类物质的含量直接进行对比;受制于现有的分析方法,本研究未能全面反映烤鱼片中AGEs形成过程,核苷酸型AGEs的形成机制还有待深入研究。总之,鱼新鲜度同其烤鱼片制品中AGEs的含量水平密切相关,鱼体在死亡或解冻后应合理安排生产周期,在确保鱼新鲜的前提下尽早将原料进行加工,以减少烤鱼片等热加工鱼肉制品中潜在危害物的含量。

4 结论

结果表明,随着鱼肉新鲜度的降低,生鱼肉和烤鱼片中同AGEs产生密切相关的游离氨基酸及核苷酸含量均呈上升趋势,部分腺嘌呤转化为次黄嘌呤;早中期糖基化产物乙二醛在生鱼肉中随时间的变化并不明显,但在烤鱼片中与时间变化呈正相关,说明烤鱼片的加工过程与糖基化反应存在直接联系;烤鱼片中总AGEs、荧光性AGEs、CML及戊糖素的含量均随时间推移而增加,说明原料鱼肉的新鲜度对烤鱼片中AGEs的含量水平具有重要影响。