二至益真胶囊对改善高龄妇女胚胎质量的效果

谢妍， 陆杉， 李思楠， 陈旭龙， 卢兴宏， 倪运萍， 杨冬宇

(广州中医药大学 第二附属医院 生殖医学科，广东 广州 510120)

随着国内二胎政策的开放，越来越多的高龄女性尝试孕育二胎，然而随着女性年龄的增长，其生育力逐渐下降，这已成为辅助生殖技术的瓶颈问题[1-3].二至益真胶囊是在李丽芸教授多年临床经验基础上研制，以补肾中药熟地黄合二至丸养血滋阴，填精益髓，川续断补肝肾强腰膝，辅以菟丝子、仙灵脾温肾壮阳，补阳益阴，能够起到调节生殖内分泌的作用，临床上用于治疗肾亏虚导致的不孕症等，运用在高龄不孕女性患者中取得良好的临床疗效.将二至益真胶囊联合辅助生育技术，可为高龄不孕的治疗提供一条新的途径，对改善高龄女性生育问题有重要的临床应用价值，但对它的作用机理还需要进一步深入研究[4-5].

近年在辅助生育领域兴起的时差成像(time-lapse，TL)技术可以连续全面地记录胚胎发育阶段各关键分裂周期的时间点、发生的异常分裂事件，这些动力学指标已成为评价胚胎发育潜能的重要参考标准，目前该技术已应用于辅助生殖领域[6].本研究拟利用TL技术观察胚胎早期发育过程，通过这些量化的细胞生物学指标可以有效评估高龄妇女的生育力，阐述二至益真胶囊能否改善高龄妇女的胚胎质量，为临床高龄不孕妇女的治疗提供理论依据.

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2019年5月至12月在我院生殖医学科行体外受精-胚胎移植(invitrofertilisation-embryo transfer，IVF-ET)助孕的肾阴虚高龄妇女，根据治疗情况分为中药治疗组和对照组，对照组直接进行IVF-ET治疗，中药治疗组先行二至益真胶囊中药治疗，然后进行IVF-ET治疗.本研究经过广东省中医院伦理委员会批准(批准文号BF2019-107-01).

1.2 诊断标准

1.2.1 不孕症诊断标准

西医不孕症标准参考《妇产科学》第9版[7]，婚后未避孕、性生活正常、同居满12个月而未妊娠者，称为不孕症.

1.2.2 肾阴虚证诊断标准

中医肾阴虚证诊断参照《中药新药临床研究指导原则》[8]制定.主证：腰膝酸软，五心烦热.次证：眩晕耳鸣，或耳聋，口干咽燥，潮热盗汗，或骨蒸发热，形体消瘦，失眠健忘，齿松发脱，经少，经闭，舌质红，少苔或无苔，脉细数.肾阴虚证需具备主证1项，次证2项即可诊断.

1.3 纳入及排除标准

1.3.1 纳入标准

(1)年龄>35周岁，(2)行IVF-ET助孕者，(3)体质量指数(body mass index，BMI)≤30 kg/m2，(4)双侧卵巢存在，(5)辨证需符合肾阴虚证.

1.3.2 排除标准

(1)反复种植失败(既往3次及以上IVF-ET失败者)；(2)重度子宫内膜异位症，包括子宫腺肌症、卵巢巧克力囊肿；(3)未处理双侧输卵管积水；(4)未治愈的子宫内膜疾病；(5)患有不适合目前进行辅助生殖技术或者不适合妊娠的疾病；(6)对研究药物过敏者.

1.4 研究方法

1.4.1 治疗方法

中药治疗组：先用中药治疗3个月经周期后再进入IVF-ET治疗过程.用法用量：卵泡期和排卵期用二至益真胶囊，每次4粒，每天3次，排卵后停服.二至益真胶囊生产批准文号：粤药制字Z20070627.对照组：不经过中药治疗，直接进行IVF-ET治疗.

1.4.2 促排卵与取卵方法

两组患者均采用相同的标准长方案进行促排卵，于前次月经的黄体中期开始应用促性腺激素释放激素激动剂进行垂体降调节.当达到降调节状态后加用促性腺激素类药物，当优势卵泡直径≥19 mm或2个≥18 mm或3个≥17 mm时，或直径≥16 mm的卵泡数占直径≥14 mm卵泡数60%以上，监测当日停用或当日最后一次使用促性腺激素，当晚注射人绒毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)，使用剂量4 000～10 000 U，注射后36～38 h左右行取卵术.

1.4.3 受精、胚胎培养及延时摄影

取卵后将卵母细胞进行回收，行常规IVF受精.将受精后的胚胎转移至微孔培养皿中培养，培养环境37 ℃，体积分数为6.0%的CO2，本研究采用Primo Vision(Vitrolife，Sweden)时差成像系统，拍照频率为5 min/次，曝光时间为70 ms/次，培养皿为微孔培养皿，连续拍摄3 d，监测胚胎的动态发育过程，比较中药治疗组和对照组胚胎分裂的时间参数(即卵裂球分裂的时间及每个分裂周期卵裂球分裂的同步性)、分裂过程中出现的异常卵裂模式发生率、两组患者优质胚胎数和可利用胚胎数等.

1.4.4 胚胎移植及妊娠检查

取卵后第3天结合胚胎的动力学参数和形态学参数标准挑选1～2 枚胚胎移植，移植后14 d检测血HCG水平，妊娠者继续黄体支持治疗，35 d后B超下出现孕囊和胎心为临床妊娠.

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 患者一般资料

中药治疗组和对照组各70例，共有13例病例未纳入分析.中药治疗组4例未能完成中药治疗，1例降调节后自然怀孕，3例因卵巢低反应取消取卵；对照组2例因个人原因放弃治疗，3例因卵巢低反应取消取卵手术.最终纳入分析病例为中药治疗组62例和对照组65例.

两组患者女方年龄、男方年龄、BMI、基础窦卵泡数(antrol follicle count，AFC)、不孕年限、基础卵泡刺激素(basalfollicle-stimulating hormone，bFSH)、基础黄体生成素(basal luteinizing hormone，bLH)、基础雌性激素(basal estrogen，bE2)、抗穆勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)比较均无统计学差异(P>0.05)，具有可比性.结果如表1所示.

表1 患者基本临床资料

2.2 患者助孕情况比较

两组患者促性腺激素(gonadotropins，Gn)启动剂量、Gn使用天数、Gn使用总剂量无统计学差异(P>0.05)，扳机日内膜厚度无统计学差异(P>0.05)；中药治疗组获卵数显著多于对照组(P<0.05)，中药治疗组患者可利用胚胎数和优质胚胎数略多于对照组，但无统计学差异(P>0.05)；两组患者正常受精率和平均移植胚胎数无统计学差异(P>0.05)；在临床结局方面，两组患者胚胎着床率和临床妊娠率均无统计学差异(P>0.05)，但中药治疗组临床妊娠率有增高趋势，结果如表2所示.

表2 两组患者的用药及治疗结局资料比较

2.3 动力学参数比较

2.3.1 时间动力学参数

本研究主要观察从受精至胚胎发育到3 d的动力学参数，将原核消失时间(time of pronuclear fading，tPNF)作为起始时间点，比较两组胚胎tPNF、t2～t8(第一次观察到n个细胞的时间)、cc2(从2细胞到3细胞的持续时间)、s2(从 3细胞到为4细胞的持续时间)、cc3(3细胞到5细胞的持续时间)、s3(从5细胞到8细胞的持续时间)共12个时间参数，结果表明中药治疗组胚胎早期发育速度(tPNF至t5)明显快于对照组(P<0.05)，t6至t8胚胎发育阶段，两组胚胎动力学参数无统计学差异(P>0.05).中药治疗组胚胎s2显著短于对照组，差异极显著(P<0.01)，两组胚胎的s3、cc2、cc3无统计学差异(P>0.05)，结果如表3所示.

表3 两组患者的胚胎动力学参数资料比较

2.3.2 异常事件发生情况

胚胎发育过程中出现的异常事件包括(1)逆分裂：在完成分裂后两个卵裂球重新融合或者未完全分裂的卵裂球最终融合；(2)1细胞直接分裂为3细胞；(3)2细胞直接分裂为5细胞；(4)碎片化：细胞碎片超过50%.对两组患者胚胎发育过程中出现的异常事件进行比较，结果表明在两组患者胚胎过程中异常分裂事件的发生率均无统计学差异(P>0.05)，但对照组的异常事件发生率有升高的趋势，结果如表4所示.

表4 两组患者异常事件发生比例比较

3 讨论

高龄女性生育问题是目前生殖医学领域面临的的难点问题，由于高龄女性对促排卵药物刺激反应不良，卵泡成熟和卵母细胞质量都会受到影响，进而获卵数减少或胚胎质量欠佳，最终影响妊娠结局[9-10].已有的研究显示，应用补肾中药在一定程度上可以提高高龄不孕妇女的卵巢储备，在此基础上联合辅助生育技术能为高龄女性不孕症的治疗提供一条新的途径[11-13]，但是其作用机制还需要进一步研究.

本研究利用时差成像技术观察二至益真胶囊对胚胎早期发育过程的影响，通过胚胎动力学参数差异的比较，评估二至益真胶囊对胚胎质量的改善，以期为今后使用该中药提供理论依据，也为优化高龄不孕患者治疗方案探索新的方向.

时差成像技术作为一种新的医学技术，提供了先进的胚胎观察模式，可以实时连续记录从受精开始的胚胎卵裂的动态过程[14].该技术通过计算机软件对胚胎分裂时间点、卵裂周期、发育过程中的关键事件等动态参数进行量化分析，其提供的动态参数和异常分裂事件的发生对于预测胚胎发育潜能和着床率具有重要意义[15].研究表明原核形成时间、第一次分裂时间、s2等与囊胚形成和胚胎着床有关，且分裂时间相对较早的胚胎具有更好的发育潜能[16-17].Meseguer[18]通过比较着床胚胎与非着床胚胎的动力学参数，结果显示着床胚胎的t2、t3、t4、t5比未着床胚胎的相应参数时间点提前，着床胚胎的s2明显小于未着床胚胎，并提出胚胎可能存在细胞分裂的最佳时间范围.本研究中使用的二至益真胶囊对改善早期胚胎分裂时间点和缓解胚胎第二次有丝分裂的不同步性具有正向调节作用，推测可能原因是通过调节卵母细胞线粒体功能而对胚胎发育起到进行正向修复作用.卵母细胞发育成熟、正常受精及后期胚胎卵裂必须有线粒体提供充足的能量才能正常进行，因此线粒体在胚胎发育过程中发挥的作用尤为关键.线粒体的功能随着女性年龄的增长而逐渐衰退，进而会影响卵母细胞及胚胎的质量.随着胚胎的发育，来自母源性的能量物质不断消耗，高龄女性的卵母细胞线粒体能量减少逐渐显现，导致胚胎发育的速度逐渐减缓.同时还须考虑高龄妇女的卵母细胞抗氧化能力下降的事实，卵母细胞抗氧化能力的减弱导致线粒体功能下降而影响其受精和发育，这也是导致胚胎发育速度受阻的主要原因[19].

胚胎的早期异常的分裂事件包括1个细胞直接分裂为3个细胞、胚胎产生大型碎片、奇数性卵裂、卵裂停滞和多核等.既往研究表明，胚胎发育过程中直接分裂及逆分裂现象可影响胚胎发育，导致胚胎植入能力降低[20-21].高龄女性卵巢功能逐渐衰退，其遗传物质发生不分离、重排断裂等畸变的概率增加，因此高龄女性的卵母细胞及相应的胚胎染色体异常概率也相应增加.胚胎出现非整倍体或基因异常是诱发卵裂模式异常的主要原因[22].本研究结果显示相比于对照组，两组胚胎异常发生率虽然没有统计学差异，但中药治疗组胚胎的异常事件发生率有降低的趋势，提示二至益真胶囊对高龄女性卵巢有一定的修复作用，和连方团队研究结果类似[23].因此推测二至益真胶囊可能通过对卵巢功能的修复而改善遗传物质的畸变而对胚胎异常卵裂模式起到一定的纠正作用.

本研究结果显示，中药治疗组与对照组相比，获卵数增加，和本团队之前的研究结果相符,本团队前期研究显示二至益真胶囊应用在高龄不孕妇女，一方面经阴道多普勒超声下卵泡的生长发育及间质血流得到改善，另一方面治疗组窦状卵泡数量有明显增加，有效地提高了高龄不孕女性卵巢储备[4-5].本研究结果显示中药治疗组的临床妊娠率和胚胎着床率有增高趋势，但两组临床妊娠率和着床率无统计学差异.由于部分患者可利用胚胎数较少、本身激素和内膜条件等的限制，只能选择积累胚胎或适当的内分泌调节后行解冻移植，需要继续大样本观察其后的临床治疗结局.

总之，对体外早期胚胎发育的时差分析结果显示补肾中药对胚胎质量的有益影响.二至益真胶囊补阳益阴，使阴得阳升而泉源不竭，有效缓解高龄女性胚胎早期发育迟缓，一定程度上减少异常卵裂的发生率，为最终的成功妊娠提供前提.这可能是补肾中药改善高龄妇女生育力的部分原因.尽管这些研究结果是初步的，但是有利于丰富补肾中药在高龄不孕女性中的应用理论依据.