三硝基甲苯分子印迹电化学传感器的制备和应用

王成，郭建良，饶国宁

（南京理工大学化工学院，江苏南京210094）

三硝基甲苯（TNT）是一种常见的单体炸药，性质稳定、爆炸威力大，广泛应用于弹药合成和装药工业，同时也常被不法分子利用，造成恐怖袭击，严重威胁着社会稳定和财产安全[1]，因此需要采取有效的爆炸物检测技术。当前，常用的爆炸物识别和探测技术分为微痕量探测技术和体探测技术，包括离子迁移光谱、激光拉曼光谱以及X 射线成像技术等，然而这些技术均存在不足[2]。分子印迹技术在爆炸物检测方面有着独特的优势。分子印迹技术是以目标分子为模板，制备对目标分子有特异选择性的聚合物[3]，即分子印迹聚合物（MIPs）。MIPs 具有与目标分子在空间结构和功能基团上完全匹配的空穴[4]，对目标分子能够进行特异性识别，其制备简单、结构稳定且可重复利用。

传感器是指通过转化器与敏感部件的配合,对特定物质具有良好选择性和可逆响应的分析装置。MIPs 可以用作传感器的识别元件，得到分子印迹传感器。分子印迹电化学传感器是基于分子印迹技术和电化学检测技术[5]，利用MIPs作为电极的敏感材料[6]，用来构建电化学传感器，其对模板分子具有高选择性的特异性识别性能，具备稳定性好、灵敏度高、制备和检测成本低等优点。

目前制作该传感器的方法分为两种，即直接聚合或间接涂滴。直接聚合是指在转换器的表面直接进行MIPs 的合成，从而在表面得到分子印迹薄膜[7]（如电化学聚合）；间接涂滴是指通过实验先得到MIPs，再将其涂滴到转换器表面[8]（如表面涂覆法）。本文先通过分子印迹技术制得TNT 的分子印迹聚合物，然后通过表面涂覆法在玻碳电极表面形成TNT 分子印迹聚合膜，制备出电化学传感器，并通过循环伏安法和差分脉冲伏安法对修饰电极的电化学行为进行考察。分子印迹技术与电化学传感器的联用有望给TNT 的检测开辟新路径。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

三硝基甲苯，军用品；2,4-二硝基甲苯（DNT），CP，国药集团化学试剂有限公司；环三次甲基三硝胺（RDX），军用品；过硫酸钾（KPS），AR，阿拉丁试剂有限公司（中国上海）；十二烷基苯磺酸钠（SDBS），AR，迈瑞尔化学技术有限公司；甲基丙烯酸（MAA），AR，国药集团化学试剂有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），AR，阿拉丁试剂有限公司（中国上海）；其余试剂均为分析纯，实验所用水均为蒸馏水。

集热式磁力加热搅拌器（DF-1），巩义予华仪器；紫外-可见分光光度计（UV,Evolution 220），美国赛默飞世尔；扫描电子显微镜（SEM,XL-30 ESEM），美国FEI；傅里叶变换红外光谱仪（FTIR, Nicolet IS10），美国赛默飞世尔；高效液相色谱分析仪（HPLC,1200），美国安捷伦；台式高速离心机（TG16-WS），湖南湘仪；真空干燥箱（DZF6050），上海精宏；数控超声波清洗器（KQ-250B），昆山超声仪器；电化学工作站（CHI660D），上海辰华仪器。

1.2 TNT分子印迹聚合物微球的制备

采用乳液聚合法制备TNT 的分子印迹聚合物。在100mL水溶液中加入12mg SDBS，搅拌混合均匀加入250mL 烧瓶；在30mL 乙腈溶液中加入227.2mg模板分子TNT、344.36mg功能单体MAA和1.982g 交联剂EDGMA，将混合溶液超声5min 形成均匀溶液，倒入250mL 烧瓶中。充分搅拌形成白色乳液，加入77.04mg 引发剂KPS，在这个体系中通15min氮气，并用真空硅脂将烧瓶密封。将烧瓶放在50℃水浴中，以250r/min的搅拌速率反应12h。反应结束后，先让体系缓慢冷却至室温，再用高速离心机分离制备的微球，分别用甲醇和乙腈洗涤以除去未反应的物质。将微球放在甲醇∶乙酸（9∶1，体积比）混合溶液中超声来提取模板分子TNT，每隔1h换1次溶液，直到提取液中检测不到TNT的紫外吸收峰。将制得的聚合物分别使用乙醇、甲醇洗涤数次，放在40℃真空干燥箱中干燥12h，从而得到分子印迹聚合物微球MIPs。按照上述步骤，在制备过程中不加入TNT，得到非印迹聚合物NIPs。

1.3 聚合物的吸附实验

1.3.1 平衡吸附实验

称取15mg MIPs 或NIPs 于10mL 离心管中，依次加入0.01～0.1mmol/mL 的TNT 的乙腈溶液5mL。将密封好的离心管置于振荡器中，25℃下振荡5h。用高速离心机离心分离，并取适量离心后的溶液用0.22µm 膜过滤。用高效液相色谱分析仪测定在245nm处的吸附溶液中的TNT浓度，平行测定3次取平均值。根据吸附前后溶液中TNT 含量的变化，使用式(1)计算聚合物对TNT的平衡结合量Q[1]。

式中，Q 是MIPs 和NIPs 对模板分子TNT 的平衡吸附量，mmol/g；C0是吸附溶液中TNT的初始浓度，mmol/mL；C是吸附平衡时溶液中的TNT浓度，mmol/mL；V 是吸附溶液的体积，mL；m 是加入样品的质量，mg。

1.3.2 吸附动力学实验

称取20mg MIPs或NIPs分散于5mL 0.1mmol/mL的TNT 的乙腈溶液中，将混合液置于振荡器中，在不同时间内结束振荡，离心分离吸附剂和吸附液。吸附液用0.22µm 膜过滤，用高效液相色谱分析仪测定吸附液中TNT的浓度，平行测定3次取平均值。同样根据式(1)计算吸附剂对TNT的吸附量。

1.3.3 选择性吸附实验

为了验证聚合物的特异吸附性，用DNT 与RDX 作为吸附竞争物，分别测定MIPs 与NIPs 对TNT 及其结构类似物的吸附能力。称取15mgMIPs于10mL离心管中，分别加入5mL不同浓度的TNT、DNT、RDX 的乙腈溶液，25℃振荡5h。离心分离吸附剂和吸附液，吸附液用0.22µm 膜过滤，测定样品对不同底物的吸附量，平行测定3 次取平均值。分离系数由式(2)计算。

式中，cp表示聚合物结合底物的浓度，cs表示溶液中底物的平衡浓度。

1.4 分子印迹电化学传感器的制备

电化学工作站三电极系统的组成包括：裸玻碳（GEC） 或者修饰玻碳电极（工作电极，直径3mm）、铂丝电极（对电极）与饱和甘汞电极（参比电极）。其中，把裸玻碳电极用0.05µm 的Al2O3粉末在麂皮上抛光成镜面，再依次用硝酸溶液（水与硝酸的体积比为1∶1）、无水乙醇和2 次蒸馏水超声5min，在室温下晾干待用。然后把0.05g 壳聚糖固体溶于10mL 乙酸溶液（2.0mol/L）中，配制成质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，在1mL0.5%的壳聚糖溶液中加入20mg MIPs或NIPs。将混合溶液超声30min，取10µL 溶液涂滴在处理好的裸玻碳电极表面（表面涂覆法），过夜晾干[9]。

用NaH2PO4和Na2HPO4配制磷酸盐缓冲液（PBS，0.2mol/L，PH=7）。以0.2mol/L 的PBS 溶液为支持电解质，用差分脉冲伏安法（DPV）来除去修饰电极的模板分子TNT，当响应曲线不再变化时表明TNT完全去除。用2次水洗净修饰电极，悬挂在空白PBS溶液上方，低温下进行保存。

1.5 电化学测试条件

采用差分脉冲伏安法（DPV）来除去印迹材料中的TNT 分子以及得到传感器的线性范围和检出限，采用循环伏安法（CV）来研究MIPs 修饰电极的电化学性质和TNT在修饰电极上的电化学响应。

差分脉冲伏安法表征：电压范围为-1～-0.1V，电压增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，采样宽度为0.0167s，背景液为空白PBS。

循环伏安法表征：电压范围为-0.2～+0.6V，扫描速率为50mV/s，背景液为0.2mol/L 的KCl 和5.0mmol/L的K3[Fe(CN)6]混合溶液。

2 结果与讨论

2.1 TNT与MAA相互作用表征

选择甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，验证MAA 能否与模板分子TNT 形成稳定的复合物。在浓度4mmol/L 的MAA 乙醇溶液中加入TNT，超声30min 充分混合后，其紫外吸收谱图如图1。可以看出随着TNT 含量的增大，溶液的紫外峰型逐渐变宽，最大紫外吸收波从331nm 处红移至373nm，吸收峰强度不断增大。说明TNT 和MAA 之间产生了相互作用力，可能是由于TNT 分子中的硝基与MAA 分子中的羧基之间形成了氢键。在聚合过程中，TNT与MAA的摩尔比选为1∶4。随着MAA浓度的增大，TNT 与MAA 的作用力也会增大，但是增加的幅度有限，并且过量的MAA 可能会使单体自聚以及产生未完全聚合的残基，导致制备的MIPs的纯度降低，特异吸附性能下降。

图1 MAA与TNT不同摩尔比溶液的紫外光谱图

2.2 聚合物的红外表征

图2 是样品的红外谱图，其中a 是模板分子TNT洗脱之前的MIPs，b是未加入模板分子制得的NIPs，c是甲醇∶乙酸（9∶1体积比）混合溶液洗脱后的MIPs。在a中，2994cm-1处出现吸收峰是样品中—CH2—的振动引起的，1730cm-1处出现吸收峰是交联剂EDGMA 中的C==O 的振动引起的，1542cm-1处的吸收峰是TNT分子中苯环的骨架振动引起的，1355cm-1处的吸收峰是TNT 分子中－NO2伸缩振动引起的。a 与b 的对比证明了MIPs 中TNT的存在。在c中，可以看出TNT的苯环和硝基吸收峰发生了明显减弱，洗脱后的MIPs 曲线和NIPs 曲线接近一致，这说明在聚合过程中结合在MIPs 中的大部分TNT 被洗脱出来，从而在MIPs 中留下了与TNT 形状、大小完全匹配的空穴，实现了对模板分子TNT的特异性吸附。

2.3 聚合物制备条件的优化

2.3.1 溶剂对聚合物形貌的影响

根据本文1.2 节中的实验方案，保持其他反应条件不变，只改变加入的溶剂乙腈的用量，研究其对样品形貌和粒径的影响。如图3所示，乙腈的用量为10mL 时样品的形状为球形，大小分布不均匀；乙腈的用量为30mL 时聚合物的形貌规则，分散性较好，没有粘结现象；乙腈的用量为50mL时，样品之间互相粘结，形成少量微球。因此选择溶剂乙腈的用量为30mL。

图2 样品的红外谱图

2.3.2 乳化剂用量对聚合物形貌的影响

根据本文1.2 节中的实验方案，保持其他反应条件不变，只改变加入的乳化剂SDBS 的用量，研究其对样品表面形貌的影响[10]。如图4 所示，当SDBS 用量为6mg 时，乳液出现分层现象，无法混合均匀，样品粘连，难以形成微球；当SDBS 用量为12mg 时，乳液乳白细腻，稳定性强，样品颗粒均匀；当SDBS用量为30mg时，乳液黏度增大，所形成的样品微球粒径出现球型，但相互粘结，分散较差。因此选择SDBS用量为12mg。

2.3.3 模板分子对聚合物形貌的影响

根据本文1.2 节中的实验方案，研究制得的MIPs和NIPs的形貌差别。如图5，相同条件下制备的MIPs与NIPs形态相似，但是NIPs的粒径略大于MIPs，同时样品发生了粘连。这可能是因为加入TNT 后，TNT 和MAA 之间的氢键作用力减少了MAA 单体的自聚。单个MIPs 中的TNT 含量增加，聚合过程更容易发生链转移和终止，因此在一定程度上导致了最终形成的样品粒径减小[11]。

图3 不同的乙腈用量制备聚合物的SEM图

图4 不同的SDBS用量制备聚合物的SEM图

图5 不同模板分子制备聚合物的SEM图

2.4 聚合物的吸附性能

2.4.1 平衡吸附性能

在0.01～0.1mmol/mL浓度范围内，测定MIPs和NIPs 对TNT 的吸附量。如图6，在此浓度范围内，当TNT 浓度增大时，MIPs 和NIPs 的吸附量都随之增大，而MIPs 对TNT 的吸附量远高于NIPs。当TNT的浓度达到0.04mmol/mL 时，NIPs对TNT的吸附量已趋于饱和。因为在洗脱模板分子TNT 后，MIPs 的内部留下与模板分子相对应的印迹空穴和功能基团，所以MIPs 对TNT 的吸附能力更好[12]。而NIPs 在经过交联聚合后，内部形成紧凑的空穴结构，功能单体的活性基团大多被包埋在NIPs 内部，所以与TNT 的结合则更多依靠表面的物理吸附作用[13]。

图6 MIPs和NIPs对不同浓度TNT的吸附曲线

为了研究聚合物对TNT 的结合特性，用Scatchard 方程对平衡吸附数据进行分析拟合，Scatchard方程式如式(3)。

式中：Q 是吸附平衡时聚合物对TNT 的吸附量，mmol/g；C 是吸附平衡时溶液中TNT 的浓度，mmol/mL；Qmax是最大表观结合量，mmol/g；Kd为离解常数。

再使用Q/C 对Q 作图，进行线性拟合，如图7所示，线性拟合方程是Q/C = 209.88- 3.118Q。MIPs 对于TNT 的化学吸附存在一种结合位点，是由于TNT 的硝基与MAA 的羧基之间形成了氢键[14]。

2.4.2 吸附动力学

图7 MIPs对TNT吸附量的Scatchard方程拟合

固定乙腈溶液中的TNT 浓度为0.1mmol/mL，MIPs 的用量为20mg，测定吸附不同时刻样品对TNT 的吸附量，研究MIPs 和NIPs 对TNT 的吸附速率，如图8。可以看出，MIPs对TNT的吸附速率远大于NIPs。在140min 时，MIPs 吸附速率降低，吸附量达到了总吸附量的95%，吸附过程趋于平衡。而在80min 时NIPs 的吸附过程趋于平衡。MIPs 中分布着空穴结构，因此在吸附开始阶段MIPs 外表面有着大量空白的印迹结合位点，对模板分子的结合速率较高，对TNT 的吸附量也迅速增加；当吸附过程进行到一定程度时，外表面的结合位点趋于饱和，TNT 便开始向MIPs 的内部扩散，产生空间位阻效应导致MIPs 对TNT 的吸附速率明显下降，最终达到饱和。而NIPs 对TNT 的吸附则更多依靠样品表面的物理吸附作用[15]，因此吸附速率较低，吸附很快就达到平衡。

图8 MIPs和NIPs的吸附动力学曲线

2.4.3 吸附选择性

选择TNT 的结构类似物RDX 和DNT 作为吸附竞争物。如图9，随着底物浓度的增大，MIPs 对3种物质的吸附量均不断增大，但MIPs 对TNT 的吸附量远高于RDX 和DNT。表1 是MIPs 对不同浓度的底物的分离常数及选择性系数计算结果。选择性识别因子α 定义为两种不同底物的分离系数之比。由表可以得出，在3种浓度条件下，MIPs对TNT的分离常数远大于RDX 和DNT，对RDX 和DNT 的选择性系数均大于4.4，说明MIPs对TNT有较好的选择性吸附能力。

2.5 分子印迹电化学传感器的表征

2.5.1 修饰电极在铁氰化钾中的表征

为了除去印迹材料中的TNT 分子，采用DPV法[9]来研究该传感器在1mg/mL 的TNT 乙腈溶液中吸附不同时间的响应曲线，如图10。可以看到，随着传感器的不断扫描，DPV 的响应电流越来越小，TNT 的硝基在转化为胺基后与MAA 的氢键断裂，从材料中洗脱出来，扫描22 次后，修饰电极的DPV 响应曲线几乎不再变化，这表明模板分子已完全去除。

图9 MIPs对TNT及其结构类似物的吸附量

表1 MIPs对不同浓度底物的分离常数及选择性系数

图10 MIPs修饰电极在PBS中去除TNT的DPV曲线

通过铁氰化钾探针，采用CV法研究MIPs修饰电极的电化学性质。图11 分别对应裸玻碳电极与不同修饰电极在铁氰化钾溶液中的伏安特性曲线。可以看出，裸玻碳电极有1 对可逆的氧化还原峰，峰电流响应之比约为1∶1。而在MIPs 和NIPs的修饰电极中，K3Fe(CN)6的可逆氧化还原峰值响应明显变小，电极表面修饰的膜严重阻碍了电子和质子在玻碳电极表面与溶液中的传递过程。当MIPs 中的TNT 完全洗脱之后，修饰电极对K3Fe(CN)6的氧化还原峰值显著提高，证明洗脱后MIPs 中存在印迹空穴。但是洗脱后MIPs 修饰电极的峰电流仍然比裸玻碳电极低，因为聚合膜致密的表面结构对[Fe(CN)6]3－离子向电极表面的扩散过程产生了阻碍，导致[Fe(CN)6]3－只能通过印迹空穴扩散到电极表面来进行氧化还原反应。

图11 玻碳电极及不同修饰电极在铁氰化钾中的CV曲线

2.5.2 TNT在修饰电极上的响应分析

采用CV法来考察TNT在修饰电极上的响应。将裸玻碳电极、MIPs与NIPs修饰电极放入0.5mg/mL的TNT乙腈溶液中富集4min，用2次水冲洗电极，接着浸入空白的PBS溶液中来考察其循环伏安响应[16]。如图12，MIPs与NIPs都有1对可逆的氧化还原峰，其中相比较NIPs，MIPs的峰型更尖锐和集中，峰电流更大，峰电位差更小。而裸玻碳电极对TNT几乎没有响应。因此可以得出MIPs对TNT有良好的吸附能力，印迹材料的吸附量也更大。这是因为MIPs中印迹的模板分子TNT洗脱后，在印迹材料的表面会形成与TNT匹配的空穴，能够有效富集且特异性识别溶液中的TNT。而NIPs修饰电极中没有与TNT结合的印迹空穴，所以对TNT的吸附则相对很少。裸玻碳电极在经过2 次水冲洗后，几乎没有吸附模板分子。

图12 修饰电极吸附TNT后的CV曲线

2.5.3 富集时间的影响

如图10，在DPV 扫描过程中，MIPs 的修饰电极有3 个还原峰，峰电位大约分别-0.43V、-0.58V、-0.73V，对应TNT的苯环上3个硝基先后得电子转变为胺基的电化学还原过程。取－0.43V处的还原峰进行分析。图13 是在0～5min 内，富集不同的时间-0.43V 电位处的峰电流值。随着富集时间的增加，峰电流增大，当富集3min 时达到最大电流值的94%，且MIPs 修饰电极在5min 内达到吸附平衡。实验表明，在吸附过程中MIPs 修饰电极对TNT 的结合速率很快，这是因为印迹薄膜上有较大的比表面积和较多的印迹位点[17]。由于薄膜的大量印迹位点都位于表面，TNT更容易进入印迹位点，因此TNT 与印迹薄膜之间的传质阻力较小，可以很快地达到吸附平衡。

图13 富集不同时间－0.43V电位处的峰电流值

2.6 传感器的性能

2.6.1 线性范围和检出限

采用DPV法研究不同浓度的电化学还原行为。将修饰好的电极浸入一定质量浓度的TNT 乙腈溶液中，来获取传感器的线性检测范围和最低检出限[18-19]，对-0.43V处的还原峰进行分析。图14是富集不同浓度TNT乙腈溶液4min后的DPV响应曲线，可以看出，当TNT 的浓度增大时，-0.43V 处峰电流也不断增大，峰电流大小与0.1～5mg/mL 范围内的TNT 浓度呈线性关系，校正曲线见图15，线性方程为y=5.62x+2.33，TNT 的检出限为0.06mg/mL(S/N=3)，线性相关系数为0.996。因此可以得出，修饰的传感器对TNT的检测有很好的灵敏度。

2.6.2 修饰电极对TNT的选择性

图14 MIPs修饰电极随着TNT浓度增加的DPV响应曲线

图15 MIPs修饰电极的校正曲线

为了衡量传感器的性能，将其应用于对TNT的特异性识别，用DNT 和RDX 作为对比，考察修饰电极的选择性吸附[20]。图16 是MIPs 和NIPs 传感器在-0.43V 处的DPV 响应电流，很明显地看出MIPs 传感器对TNT 的响应电流最大，分别是DNT和RDX的3.13倍和3.27倍。而NIPs传感器对TNT、DNT 和RDX 的响应电流相差不大。观察三者的结构，DNT 和TNT 的结构比较接近，但DNT 的苯环上比TNT 少了1 个硝基，导致与MAA 的相互作用力更薄弱，所以MIPs 对其虽有一定的吸附作用，但吸附能力更差。以上数据表明，MIPs 传感器表面的结合位点可以与TNT 进行特异性结合，构建的MIPs 传感器对TNT 分子具有很强的特异性识别能力。

图16 修饰电极对TNT的选择性吸附

3 结论

（1）以MAA 为功能单体，TNT 为模板分子，采用乳液聚合法制备TNT的分子印迹聚合物MIPs。将制备的MIPs 分散在溶剂中，通过表面涂覆法制备出TNT的分子印迹电化学传感器。

（2）当溶剂用量为30mL、乳化剂用量为12mg时，制备的MIPs 形貌规则、粒径均匀。MIPs 对TNT 的吸附量随着TNT 初始浓度的增加而增加，140min 后达到最大吸附量的95%。MIPs 对TNT 的分离常数远大于RDX 和DNT，对RDX 和DNT 的选择性系数均达到4.4以上，说明MIPs对TNT有较好的选择性吸附能力。

（3）铁氰化钾探针实验和对TNT 的响应曲线验证了电化学传感器的成功制备，富集时间实验得出该传感器富集3min 就可以达到最大电流值的94%。

（4）检测范围实验和选择性吸附实验表明当TNT 的浓度在0.1～5mg/mL 范围内时，可与峰电流呈现良好的线性关系，检出限是0.06mg/mL。该传感器对TNT 的电流响应分别是DNT 与RDX 的3.13倍和3.27倍，表现出很强的特异性识别能力。这种TNT的分子印迹电化学传感器有望给快速、灵敏地检测TNT 以及开发研制便携式检测仪器等工作提供新的思路。