一株Coniella属真菌的分离培养鉴定及抑菌活性实验

张志博 张亚男 张笑 刘丽菲 贠娜娜 田慧敏

摘 要：从赤芍（Paeonia lactiflora Pall）植株根部分离到一株内生真菌（编号Gen7）.该菌菌丝无色，具隔膜，分生孢子梗短或无，分生孢子椭圆形初为无色，后为棕色;根据形态学特征鉴定为Coniella属.基于ITS的BLAST检索表明该菌株与Coniella fragariae相似度高达99.6%以上，鉴定为草莓垫壳孢Coniella fragariae （Oudem.）B.Sutton，该菌属于半知菌门，球壳孢目spharropsidales，球殼孢科Sphaeropsidacea垫壳孢属Coniella，为内蒙古新记录种，以黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen、灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea Pers和茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi et al. 为材料，研究其抑菌活性，发现Coniella fragariae （Oudem.）B.Sutton对3种指示菌有不同程度的抑制作用，平均抑菌率分别达48.2%、43.1%和24.7%，该研究结果为内生真菌分离培养鉴定提供研究提供方法，并为潜在生防菌的开发利用提供理论依据.

关键词：Coniella属真菌;培养鉴定;抑菌活性

中图分类号：Q914.83  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）06-0033-03

植物内生真菌是指在健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌[1]，主要为子囊菌及其无性型，少数担子菌和接合菌.内生真菌感染植物组织，一般以菌丝存在于细胞内和细胞间，从寄主中吸收营养物质供其生长所需，同时内生真菌为寄主生长发育提供水分、矿物质元素等，二者互利互惠[2].植物内生真菌普遍存在于植物组织中，种类多，代谢物不仅能刺激植物生长发育、增强寄主的抗逆性，如抗旱、抗寒等能力[3-5]，而且能提高植物对病虫害的抵抗力[6-10]，研究发现植物内生真菌能产生具有多种生物活性的新型化合物，如抗生素、植物生长调节剂、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等，极有可能成为发现和生产生物活性物质的重要来源，在医药、农林业等领域具有潜在的应用前景.

真菌传统的分类鉴定主要是根据产孢结构和方式、孢子的形态学特征来确定.但有些内生真菌在自然条件和人工培养条件下均以菌丝和无形态形式存在，因此给形态鉴定带来困难，ITS即内部转录间隔区，是核糖体DNA（rDNA）中的非编码转录间隔区，该区域基因在不同菌株间存在丰富的变异，国内外对ITS区进行序列分析技术已很常见，在真菌的分类鉴定及系统发育等研究报道很多.本文采用形态学鉴定和ITS测序法对一株内生真菌进行分离培养鉴定并对其抑菌活性进行研究.

1 材料和方法

1.1 供试材料

赤峰学院校园内赤芍（Paeonia lactiflora Pall）为材料，截取健康新鲜的芍药侧根进行内生真菌的分离.

1.2 内生菌的分离和纯化

取健康芍药植株侧根用自来水冲洗干净晾干，分别用0.1%升汞漂洗10～30s，然后用无菌水冲洗，再用75%酒精漂洗0.5～1min，最后用无菌水冲洗数次.样品经处理完毕后，在超净工作台内无菌状态下切成0.2cm薄片，切口置于PDA培养基上，每个培养皿3个样品.置于28℃条件下黑暗培养3～7d，观察培养材料切口处长出菌丝，挑取切口处菌落边缘菌丝转接到新的PDA平板上，经2～3次纯化，得到纯培养.

1.3 内生菌的形态鉴定

1.3.1 宏观特征观察法

根据内生真菌在PDA培养基上的培养特征，包括菌落正面和背面颜色、纹饰、质地以及边缘形状、生长速度、大小进行观察，使用手机拍照记录.

1.3.2 显微观察

挑取获得的纯培养菌丝，制成徒手切片，镜检观察菌株菌丝及产孢结构，如：分生孢子梗、分生孢子形态及大小等.依据真菌分类文献进行分类鉴定.

1.4 基于rDNA～ITS测序分子鉴定

将纯培养菌丝加入液氮充分碾磨，取真菌组织约30mg，提取基因组DNA，用天根PFU PCR mix进行PCR扩增，引物ITS1F/ITS4R，对所得PCR产物进行切胶纯化回收（DNA凝胶纯化试剂盒，AXYGEN），使用NL4对回收DNA片段进行DNA测序.

1.5 数据处理

用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件在16S数据库中的数据进行比对，得到比对结果，从结果中挑选出同源性较高的DNA序列，查找相似性最高的菌种，确定分离菌株的分类地位.利用软件MEGA5.1按照最大似然法构建系统进化树，发育树的每个分支的统计学显著性分析重复次数为1000次.

1.6 该菌株对几种植物病原菌株的抑菌实验

1.6.1 指示菌

采用植物常见病原菌，黄瓜枯萎病菌黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen 、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum和灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea Pers菌株均来自微生物实验室.

1.6.2 实验方法

采用对峙培养法，在无菌操作台上分别取指示菌定量接种，在固体培养基中，挑取内生真菌菌丝或孢子，每个样品做3个重复.培养皿置于室温培养，分别于培养3天、5天、9天后测定抑菌圈直径大小，重复多次，检测其抑菌效果.

1.6.3 抑制效果计算方法

在无菌操作台上将三种指示菌接种于PDA培养基（d=10cm）中心，周围接种Gen7，接种3个接种点，置于室温24℃，培养72h后开始测量抑菌圈直径，抑菌率=DCK～DX/DCK×100，DCK=CK菌落直径，DX=对峙培养后尖孢镰刀菌的菌落直径.

2 结果与分析

2.1 Gen7菌株鉴定结果

2.1.1 形态学特征

培养特征：菌落起初白色，棉絮状，背面呈灰白色，后期菌落会有黑棕色环形条纹，背面橘黄色，中央色深.最后整个菌落变为黑色.

显微特征：分生孢子梗未见，产孢细胞圆柱形，无色，光滑，直径6～9μm，分生孢子初期无色长椭圆形，单胞顶端钝圆，无色，有的有两油滴，孢子6～8.4μm×4～6μm.

2.1.2 基于rDNA-ITS构建系统发育分析

以Gen7所测两条序列Gen7-1和Gen7-2的ITS基因序列在Genbank數据库BLAST搜索，表明Gen7-1、7-2与Coniella fragariae（MH861493）相似度100%，Coniella fragariae （MG748688）相似度为99.61%，而与葡萄白腐病菌Coniella diplodiella 90.61%亲缘关系较远，与桉树小帽壳孢菌Pilidiella eucalyptorum相似度90%，Pilidiella为Coniella同物异名，都属于半知菌门，球壳孢目spharropsidales球壳孢科Sphaeropsidaceae.

2.1.3 Gen7鉴定结果

根据垫壳孢属Coniella态特征的描述[11，12]结合分子鉴定结果，该菌为草莓轮纹叶斑病病原草莓垫壳菌Coniella fragariae（Oudem.）B.Sutton.

2.2 抑菌试验结果

对Gen7菌株与黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers进行抑菌实验，结果表明，Gen5对所测试菌均具有不同程度的抑制作用.

从表中可以看出菌株Gen7对黄瓜尖镰孢菌平均抑菌率达48.2%，对灰葡萄孢菌最大抑菌率达43.1%，对茄科劳尔氏菌的平均抑菌率24.7%，培养一周后对镰孢菌最大抑菌率70.6%，能明显抑制黄瓜枯萎病菌的生长，对灰霉病菌最大抑菌率达到62.5%，能明显抑制灰霉病的生长，而对茄科病菌抑菌率最大为24.7%，具茄科青枯病菌生长具有一定的抑制作用.

Gen7对黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea在第4天时，抑菌圈达到最大分别为48.8mm、20.7mm、40.7mm，抑制作用极强，5天后菌落直径30mm以上，完全被抑制，生长缓慢基本停止，7天后抑菌率70%以上，完全被覆盖.

3 讨论

本研究从芍药根部分离的一株真菌Coniella fragariae，该种存在的变形结构，常被误定为Pilidiella属，该种分布广泛，是植物病原之一，可侵入植物根、茎、叶，寄主范围较广，同时也可腐生于动物粪便中，研究表明从鹅肺中分离出的菌株提取的化合物抑制肿瘤细胞的迁移[13].尖孢镰刀菌、灰霉病菌和番茄青枯病菌具有很强的抑菌作用，为开发园艺植物病害生防菌提供理论依据，本研究对内生真菌仅做了分子鉴定及简单的抑菌实验，而内生菌发酵产物的功能还需进一步研究，为菌物资源的鉴定及安全开发提供依据.

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收稿日期：2020-04-01

基金项目：内蒙古自治区创新创业训练项目（201810138009）

通讯作者：田慧敏（1980～），女，硕士，副教授，主要从事真菌学多样性教学及科研工作，E-mail：tiancfxy2009@126.com