基于非线性化学指纹图谱的羊乳广谱掺假检测研究

缑敬轩，刘义，刘征，樊成，董文宾

(1. 陕西科技大学食品与生物工程学院，西安710021；2. 陕西省产品质量监督检验研究院，西安710048)

0 引 言

羊乳中含有200 多种营养物质和生物活性因子，以其营养丰富、易于吸收等优点被视为乳品中的精品，被世界公认为乳制品中最接近母乳、营养成分全、易被人体吸收的乳品[1]。但是由于羊乳的产量低，供不应求，因此价格也远远高于牛乳[2]。为牟取暴利，在羊乳中掺杂使假现象不断发生。掺假物质从传统的掺水、淀粉、尿素等，发展到掺水解动物蛋白、水解植物蛋白、植脂末等，甚至还发现有亚硝酸盐、吐温80 等有毒物质[3]。目前的检验方法无论是传统的理化检验方法还是基于现代仪器分析的检测方法，大部分为具有高度专一性的单一物质检测法[4]。但是在日常工作中，很难对每一批次样品中所有可能的掺假物质一一检测。检测方法落后于掺假物质的更新，三聚氰胺事件发生之初，检测部门都还没搞清楚这究竟是一种什么物质，更不用说及时开发与之相适应的检测方法[3]。因此迫切需要开发新的检测方法能够一次检测即可判定样品多种掺假物质的有无即针对多种掺假物质的广谱检测方法，并且对于一些新的潜在可能使用的掺假物质同样有效。

非线性化学指纹图谱技术是一种基于远离平衡条件下的化学震荡和化学湍流等非线性化学反应的技术，它通过样品成分参与或影响非线性动力学反应，获得反应过程中电位随时间变化的曲线，即该样品的指纹图谱[5]。它将样品所有成分作为一个整体来检测，因此反映的是样品的整体信息[6]。目前已有根据指纹图谱的直观特征或者系统相似度及其它图谱参数进行药材和食品真伪的鉴别以及掺假的定性定量检测[5-8]。

本研究利用该技术建立羊乳掺假的广谱检测方法，以期通过一次检测，即可排除多种掺假物质，从而减少检测的工作量，并防止某些新型掺假物质的使用。

1 材料和方法

1.1 样品

羊乳样品购自三原兴牧乳山羊养殖专业合作社及附近农户家中共32 份。以氯化钠、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖作为待测掺假物质，随机选取三份生鲜羊乳样品分别添加0.5%、1%和5%的掺假物质，共得到掺假羊乳样品36份。

1.2 试剂

硫酸，天津市红碧化学试剂厂；溴酸钠，广州省化学试剂工程技术研究开发中心；丙酮，天津利安隆博华医药化学有限公司；硫酸锰，天津市福晨化学试剂厂；氯化钠，天津市天力化学试剂有限公司；尿素，天津恒兴化学试剂制造有限公司；蔗糖，天津市科密欧化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。大豆蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；生物试剂；水为重蒸蒸馏水。

1.3 仪器

MZ-1B 型非线性化学指纹图谱分析仪，湖南尚泰科技有限公司；217 型复合甘汞电极和213 型金属铂电极，上海精密科学仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 测定方法

非线性化学指纹图谱测定方法，同马永杰[9]。

1.4.2 分析方法

以所有羊乳样品指纹图谱参数的平均值为羊乳标准品的指纹图谱参数，计算各个纯羊乳样品及掺假样品与羊乳标准品的相似度值[10]，以纯羊乳最低相似度值为临界值，若待测样品的相似度值低于临界值，则判定该样品为不合格或掺假样品，若待测样品的相似度值大于临界值，则判定待测样品为正常。对于未发生震荡的样品可直接判定为掺假或者不正常样品。数值处理及绘图分别采用Matlab2014和origin2018。

2 结果及讨论

2.1 纯羊乳相似性比较

采用非线性指纹图谱测定方法测定所有纯羊乳样品共计32 份的指纹图谱，并统计指纹图谱参数，以所有样品指纹图谱参数的平均值作为纯羊乳标准品的参数，然后计算所有纯羊乳样品与标准品之间的相似度值，结果如表1 所示，所有纯羊乳与标品相似度值在91.8%～83.4%，其Rsd为2.91%。

2.2 图谱比较

样品不同成分含量的变化都会影响到指纹图谱的图形，纯羊乳样品由于成分含量相似，因此指纹图谱也具有相似性，不同样品的指纹图谱直观差异不大，见图1。若待测样品的指纹图谱与正常纯羊乳相比有的显著差异则说明该样品为掺假乳或非正常生鲜乳。

图1 纯羊乳指纹图谱

图2 含氯化钠羊乳样品的指纹图谱

含氯化钠的样品均未发生震荡，电位-时间曲线为平滑曲线，与纯羊乳的震荡曲线完全不同，故掺氯化钠0.5%以上的样品可直接通过图形的差异判定样品为掺假或不合格羊乳。

图3 含大豆蛋白胨羊乳样品的指纹图谱

表1 纯羊乳指纹图谱参数及其相似度范围

添加大豆蛋白胨的样品中，5%含量的未发生震荡，因此曲线与正常羊乳曲线明显不同，可直接判定。而1%和0.5%含量的指纹图谱与纯羊乳的指纹图谱具有一定地相似性，故需进一步通过相似度比较进行判定。

图4 含尿素羊乳样品的指纹图谱

添加不同浓度尿素的样品虽然均发生震荡，但是指纹图谱与纯羊乳的图谱直观上具有明显的差异，无论是震荡起始时间、振幅还是震荡寿命等与纯羊乳明显不同，因此也可通过指纹图谱的直观比较判定。

图5 含蔗糖羊乳样品的指纹图谱

5%蔗糖掺假样品的指纹图谱与纯羊乳指纹图谱图形差异显著，也可以通过直观的图形观察直接判定，但1%和0.5%的蔗糖样品震荡图形需要通过相似度计算来进行判定。

故通过图形的直观比较，可判定添加0.5%以上氯化钠或尿素样品和5%以上大豆蛋白胨或蔗糖的样品为不正常或掺假样品，而添加量小于5%的大豆蛋白胨或蔗糖样品还需通过相似度计算进行判定。

2.3 相似度比较

以32 个羊乳样品的参数平均值作为羊乳标品的指纹图谱参数。计算纯羊乳与标品相似度，相似度值越高说明样品与标品的差异越小，相似度值越小，则样品与标品的差异越大，相似度值过小，则说明样品中可能掺假或者不合格。本研究中纯羊乳相似度值最高91.8%，最低83.4%，平均87.4%.故以83.4%作为相似度临界值，若待测样品的相似度值低于相似度临界值则判定为掺假或不合格羊乳；反之则判定为未掺假或合格的纯羊乳。

分别抽取三个不同纯羊乳样品，添加不同浓度的氯化钠、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖等。测定其指纹图谱及其参数，并计算不同浓度掺假物样品与纯羊乳标品相似度，每个样品平行测定三次，取其平均值，结果如图6所示。

图6 掺假羊乳样品相似度

由图6 可知，除添加氯化钠样品及含5%大豆蛋白胨样品未发生震荡，其相似度值为零外，0.5%和1%大豆蛋白胨样品以及所有含尿素样品的相似值均小于临界值83.4%，含蔗糖的样品中，添加5%蔗糖的样品相似度值均小于临界值83.4%，而添加1%和5%蔗糖的两类样品相似度值或大于或小于临界值，但均接近临界值83.4%，故这两类样品还不能用临界值的方法进行判定是否掺假。

就以上样品测定结果来看，氯化钠、大豆蛋白胨和尿素在0.5%添加量水平可以用该方法定性检测，而蔗糖在5%添加水平可判定是否掺假，低于5%则不能确定是否掺假。因此对于以上几种掺假物质，在5%的添加水平该方法可以有效检测。掺假以获得非法高利润为目的，通常掺假量会足够大[11]。因此该方法可用于纯鲜羊乳收购中以上几种掺假物质的定性广谱检测。

3 结 论

本研究对纯生鲜羊乳及添加不同浓度氯化钠、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖的生鲜羊乳的非线性指纹图谱进行研究和对比。结果表明通过图谱的直观比较即可判定纯生鲜羊乳添加0.5%以上氯化钠或尿素样品和5%以上大豆蛋白胨或蔗糖的掺假行为，而通过比较相似度值的方法可以判定氯化钠、尿素和大豆蛋白胨3 种物质在0.5%以上浓度的掺假行为以及5%以上蔗糖掺假行为, 因此该方法可用于生鲜羊乳的以上几种掺假物质的广谱检测。随着考察的掺假物质种类的增加，该方法能够确定检测的掺假物质的种类必然也会增加。该方法的最大的优点在于检测方法的广谱性，即一次测定，就可检测生鲜羊乳中多种掺假物质的有无，本研究通过相似度值可同时判定是否存在氯化钠、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖四种物质的掺假行为，随着更多掺假物质的检测验证，相似度法能够判定的掺假物质必然会更多，从而极大的减少生鲜羊乳食品安全检测的工作量。在实践中如果纯生鲜乳的样品数量再多一些，并且能够按照季节、地区或者羊的品种等因素分类建立标准乳及相似度临界值，则判定模型有可能会更加准确。