牛乳蛋白过敏及酶水解降低其致敏性的研究进展

党慧杰，郑远荣，刘振民，庞佳坤，包怡,3，姜姝,3

（1. 乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海200436；2.上海海洋大学食品学院，上海201306；3.上海大学生命科学学院，上海200444）

0 引 言

牛乳蛋白(Cow milk proteins, 乳蛋白)营养丰富，几乎含有人体所有的必需氨基酸，在婴幼儿的生长发育中起着较为重要的作用[1]。其组成接近人乳，但在含量上存在一定差异，部分人群可能会因为摄入而出现皮肤、胃肠道或呼吸等方面的疾病[2]，还可能涉及多个靶器官，导致复杂的全身过敏反应，可能引发死亡风险[3]。这是典型的由免疫系统介导的食物过敏现象，牛乳过敏是婴幼儿常见的食物过敏，患病率报道不一，约为2%～7.5%[4-5]。

目前，还没有牛乳过敏的治疗方法，若确诊过敏，只有通过完全避食预防[6]。然而，总是避免牛乳及其制品的摄入可能会导致营养不良，甚至影响婴幼儿生长。为了解决这一问题，已有众多学者研究了蛋白质改性技术[7-9]来消减乳蛋白的致敏性。其中酶解改性应用较为成熟[10-12]，酶催化大分子的蛋白质水解成为小分子肽和氨基酸，破坏过敏原蛋白的线性或空间构象，从而显著降低其致敏性[13]。而且，还具有省时、经济，有功能新肽的产生等优点[14]，在工业上已广泛应用于生产低致敏婴儿配方乳粉，如市售的部分或深度水解配方乳粉。但是，部分水解配方乳粉可能含有乳蛋白致敏片段残留[15]。深度水解配方乳粉则大都存在风味差，乳化性不好等缺点[16]。随着研究的深入，酶结合其他先进的预处理技术应用到了降低牛乳及其制品的致敏性中，以更优的口感、营养和功效而被广泛研究，具有较好的应用前景。

1 牛乳蛋白致敏机制

食物过敏是指人体对外来抗原的异常免疫反应[17]，食物中能够引起机体免疫系统异常反应的成分即为食物过敏原，一般为蛋白质。乳蛋白约占牛乳的3%[18]，至少有25 个不同种类，且都可能作为过敏原[3]。其中，最主要的过敏原是酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-Lact⁃albumin，α-LA)。这些蛋白和人乳在蛋白质类型、含量和同源性上面存在较大差异，含有可以被人体免疫系统识别的线性或构象表位，当被摄入时，可能会被免疫系统识别为“有害”物质，成为过敏原，经过抗原呈递细胞传递，刺激辅助性T 细胞（Th0）分化成少量Th1 和大量的Th2。Th1 细胞产生特征性细胞因子IL2 和干扰素（TNF），刺激激活的巨噬细胞产生免疫应答。Th2 细胞产生特征性细胞因子IL4 和IL5，IL5能够刺激嗜酸粒细胞，IL4 刺激B 细胞激发成为效应B细胞，产生大量的抗体，多数为免疫球蛋白E(Immu⁃noglobulin E，IgE)，少数为免疫球蛋白G（IgG）。经过血液循环，IgG 附着到嗜酸粒细胞上，刺激其产生组胺。IgE 结合到肠道黏膜和气管中的肥大细胞或血液中的嗜碱性细胞上面，当再接触抗原物质的时候，发生反应，刺激肥大细胞产生组胺等化学物质，引起一系列的过敏反应，详见图1。研究显示，牛乳过敏大多由IgE 介导，引发较为严重的过敏症状，出现皮肤、呼吸系统和胃肠道部分的疾病，具有速发性。少部分的轻到中度的牛乳过敏通常是非IgE 介导的，相关的临床表现为乳蛋白诱导的轻度直肠出血或重度呕吐，发病较为缓慢[19]。

图1 牛乳过敏机制示意图[20]

2 牛乳主要致敏蛋白

2.1 酪蛋白

酪蛋白约占乳蛋白的80%[21]，具有松散且高度水合的三级结构，被分为αs1、αs2、β-和κ-CN4 种[18]。αs1、αs2 和β-CN 可与钙等多价阳离子强烈结合，位于酪蛋白胶束的中心疏水区，κ-CN 含有少量的磷酸盐基团，钙结合能力弱，位于外周亲水层[22]。正是由于这样的结构特点，酪蛋白容易被蛋白酶降解[18]。

目前对于4 种酪蛋白的二级、三级结构有较为清楚的认识[6,23-25]，针对特定酪蛋白的致敏性也有许多的报道。Natale[26]的研究显示，大约50%的乳蛋白过敏患者对αs1-CN 敏感，对αs2-CN 的敏感率为90%。已有许多的学者通过酶法切割、肽芯片免疫分析、肽定位等技术确定了这些蛋白的致敏片段[27-29]，甚至确定了一些IgE 结合的关键残基[30]。Busse 等[31]在77%的牛乳致敏患者中检测到了αs2-CN 上的6 个小的以及4个主要的 IgE 结合片段。Cerecedo 等[27]确定了 4 个αs2-CN 的致敏区域，其中有一个和Busse 的研究相同。Chatchatee等[25]发现了β-CN 上的6 个主要的和3个小的IgE 结合片段。详见表2。但是，由于各项研究采用的方法不同，定位到的致敏片段有所差异，但是通过比较也不难发现，在这些致敏蛋白上的一些片段的致敏性是公认的，如αs1-CN 的氨基酸序列的第69-78 位 以 及 173-194 位 、αs2-CN 的 171-180 位 、β-CN 的 55-70 以 及 173-194 位 和κ-CN 的 第13-22、34-44位以及155-164位。

表2 主要牛乳致敏蛋白的抗体识别序列

2.2 乳清蛋白

乳清蛋白约占乳蛋白的20%，主要的致敏组分为α-LA 和β-LG[18]。乳清蛋白具有较高的二级、三级结构，它们没有被磷酸化，并且含有分子内的二硫键，故结构较稳定[22]，这种结构对其致敏性起重要作用。根据不同的研究对象，牛乳过敏患者中α-LA 的特异性IgE 患病率在27.6%～62.8%之间[32-35]。β-LG 被认为是乳蛋白中最重要的过敏原，它在牛乳中含量较高，且在人乳中不存在，约有80%的牛乳过敏患者对β-LG过敏[23]。

Jarvinen 等[34]研究了11 位牛乳过敏患者血清对于α-LA 的识别，发现了 4 个 IgE 结合片段。Hochwarner等[35]研究α-LA 的致敏性，确定了α -LA 上的 6 个 IgE结合片段。Li 等人[36]确定了α-LA 上 6 个线性 IgE 结合片段，其中有两个片段和Jarvinen 等人先前的研究结果一致。许多学者指出，β-LG 的121-134 位对于蛋白质水解具有很高的抵抗力，是最具致敏潜力的片段[37-38]。Jarvinen 等[34]鉴定了β-LG 氨基酸序列上的 7个IgE 结合片段，但只有3 个被认为是免疫显性的，其中一个片段为121-134 位，这对应了前人的研究。Cerecedo 等[27]从过敏患者血清中鉴定出位于β-LG 肽段58-77 位的3 个片段，能够被75%以上的受试者识别。Cong 等[30]确定了 4 个β-LG 的 IgE 结合片段和 2个 IgG 结合片段，且指出 20、23 和 27 位是 IgE 结合的关键氨基酸。

3 酶解乳蛋白的相关研究

蛋白酶可以水解蛋白质肽链，破坏过敏蛋白的结构，从而显著降低蛋白质的过敏性。对于牛乳蛋白来说，蛋白酶可以将其水解为小分子乳蛋白、乳蛋白肽甚至是氨基酸，能够降低它的致敏性[20]。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。图2 显示了用胰蛋白酶水解β-LG 后剩余的5 个氨基酸序列（T6、T17、T18、T20 和T21）在未水解的β-LG 中的定位，乳过敏小鼠实验表现为耐受，表示该酶能够有效的把β-LG 上致敏的肽段切除。Prakash 等[40]用水解度5%的中性蛋白酶水解酪蛋白，通过间接酶联免疫吸附法检测，发现在兔血清中，酪蛋白的致敏性降低了70%～80%，且验证实验显示，血浆中的特异性IgE 含量和组胺水平都显著降低。Babij 等[41]通过测定水解度、游离氨基酸强度以及色谱分析，研究一种丝氨酸蛋白酶水解乳清蛋白和酪蛋白对乳过敏患者的影响，发现这种酶可显著降低蛋白质的抗原性。

工业配方乳粉大多采用的是较为成熟的酶解技术，即热加工辅助酶解法。但是，在应用过程中，热加工辅助酶解法也暴露出了一些诸如影响乳制品的营养和感官品质等缺点[43]。随着研究的深入，在低致敏性乳制品生产方面也探索了一些兼顾减敏功能、营养以及赏味性的新型的非热加工辅助酶解技术。目前，基于对定向酶解机制的深入探索，也发表了一些成本更低，效果更优的酶解前沿的技术。

图2 原β-LG序列上耐受胰蛋白酶肽定位[42]

3.1 热加工辅助酶解法

单一的热处理工艺处理也会影响乳蛋白的抗体识别能力，但是酪蛋白对于热处理非常稳定，研究表明，120 ℃加热15 min 对其致敏性无影响[44]，热处理温度过高对牛奶的营养影响较大。热加工辅助酶解法通常采用巴氏杀菌，避免了单一的热处理过高的温度，在加热过程中，乳蛋白的空间结构发生改变，一些隐藏的致敏表位暴露，从而加强酶的作用效果。Iametti 等[45]用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在60 ℃，中性pH 条件下水解β-LG，通过质谱分析发现，这两种酶能够有效的水解在加热过程中短暂暴露的β-LG 的某些区域，经过处理后，大多数致敏的表位位点消失。Kim 等[46]探究了胰蛋白酶和胃蛋白酶水解对于50 ℃热处理前后的浓缩乳蛋白的水解物产率和致敏性的影响，发现在经过热处理后水解度更高，致敏性降低更显著。韩仁娇[47]探究了两个中性蛋白酶复合水解β-LG 的最优工艺条件，发现F 酶和G 酶同时分别添加0.44%和0.08%，酶解温度55.2 ℃时，β-LG 水解率高达58.99%，明显优于市售同类产品。

热加工辅助酶解法能够有效降低牛乳的致敏性，复合酶的作用位点更多，其作用效果较单一酶更好，水解更充分[48]。但是也存在一定的缺点，可能产生对乳制品的营养和感官品质产生不利的影响，另一方面，热加工辅助酶解法破坏蛋白质的空间结构，可能出现一些新的致敏表位[20]。

3.2 非热加工辅助酶解法

酶解工艺经非热加工处理能够更好的消除牛乳的致敏性，同时还兼顾牛乳的赏味性和营养性[49]。常用的非热加工技术有超高压、硫化、发酵等。这些技术能够改变乳蛋白的结构，和酶共同处理乳制品可以不可逆的去除乳蛋白的致敏原，从而使过敏表位不再被免疫系统所识别。Blayo 等[50]用超高压均质的方式处理乳清蛋白发现和未处理的样品相比，乳清蛋白对胰蛋白酶攻击的敏感性更强，蛋白的水解效率更高。Kananen 等[51]用硫化氢使蛋白构象改变，后用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理，β-LG 的抗原性极大的降低。Cross[52]提出酶解之后再进行乳蛋白发酵处理，改性效果更好。

近年来，随着一些新兴的食品处理技术，如微波、超滤等技术的逐渐发展和趋于成熟，也逐渐应用到了辅助酶解降低牛乳致敏中。Ei[11]研究了微波联合胃蛋白酶水解牛乳蛋白对β-LG 致敏性的影响，结果显示，65 ℃的时候，常规处理的β-LG 有37%的部分能够抵抗胃蛋白酶的分解，但微波处理该蛋白，则完全水解。Quintieri 等[53]采用4 种酶结合超滤技术依次处理乳蛋白，处理后的电泳图谱显示β-LG 带消失，证实酶结合超滤技术共同作用于浓缩乳蛋白具有良好的降低致敏性的效果。

非热加工辅助酶解技术能够很好地避免热加工对牛乳造成的营养和感官特性的影响，作用效果优良，但在应用中，还应该关注对牛乳品质以及保藏方便的影响。

3.3 酶解前沿技术

酶水解能够很好地降低乳制品的致敏性，且技术逐渐成熟，主打低致敏性的配方乳粉也逐渐增多，但是也存在选酶的盲目性，酶解产物具有随机性，定向酶解机制不清楚等问题。而且，酶解后产生的一系列的生物活性肽对人类健康的促进作用也有待探索。目前在酶解降低乳蛋白致敏的较为前沿的研究主要集中在开发新型的肽酶、建立提高酶解效率的化学或生物体系、酶解产物进行鉴定以及靶向优化上面。Oliveira 等[12]探究了4 种植物根茎或动物乳汁中的肽酶水解酪蛋白对其致敏性的影响，动物实验表明，其中的两种肽酶的水解物在牛乳过敏的小鼠中未出现过敏反应。这些肽酶可以作为工业用酶，开发低致敏性配方乳粉。Shahriari 等[54]探讨了不同水稻硫氧还蛋白（Thioredoxins，Trxs）还原β-LG 中的二硫键，对胰蛋白酶消化率和β-LG 致敏性的影响，发现能够很好地提高胰蛋白酶的消化率并且降低了该蛋白的致敏性。尤其是两种植物Trxs 比大肠杆菌和动物Trxs 成本更低。并建立了一个重组水稻谷胱甘肽/硫氧还蛋白系统，能够特异性提高β-LG 的胰蛋白酶消化率。Nongonierma[55]提出用靶向酶解乳蛋白提高特定生物活性肽的释放，开发能够改善人类健康的水解物。

在应用酶降低乳蛋白致敏性的研究中，探索高效且成本低的定向酶解技术，开发兼具减敏和益于人体健康的水解物成为研究的关键。

4 总 结

目前对于牛乳蛋白致敏的基础性研究比较深入，致敏机制也逐渐清楚。应用酶水解牛乳蛋白的研究较多，对于酶解液的功能性研究方面也逐渐加强[56-57]，但是实际应用中也存在一些问题。综上，关于应用酶处理牛乳降低致敏性可以加强一下几方面的研究：（1）整合已经掌握的过敏原表位信息以及酶作用位点的情况，探索定向酶解的方式和机理。（2）筛选新型酶，以及对复合酶的应用做更多研究，探索较优的工艺。（3）进一步探究一些新技术如辐照、超声波等辅助酶解技术的效果。（4）加强对酶解产物的分析和研究，开发具有新的功能的水解物，提高乳品的附加值。总之，目前应用于酶解降低牛乳致敏性的研究还需要进行更加深入细致的探究，优化生产工艺，提高生产低致敏乳品的安全性，为我国的乳品工业的建设提供强大的助推力。