乳酸菌素原料中有机酸的测定分析

2020-09-22马晓娟谢有发刘文君乔培钟地长李诒光余银芳

中国乳品工业 2020年8期

马晓娟谢有发刘文君乔培钟地长李诒光余银芳

（江中药业股份有限公司，南昌，330096）

0 引言

乳酸是乳酸菌发酵中的主要代谢产物，结构式为CH3CHOHCOOH，由于分子内含有一个不对称碳原子，因此具有旋光异构现象，可区分为L-乳酸和D-乳酸，当两者以等比例混合时，即成为内消旋的DL-乳酸。由于人体只含有L-乳酸脱氢酶，从而能分解自体产生的或摄入的L-乳酸，不能代谢D-乳酸[1]。世界卫生组织（WHO）明确规定，人体每天摄取D-乳酸的量限定在100 mg/kg 体重以下，而对L-乳酸不加限制[2]。目前研究食品与药品中的L-乳酸、D-乳酸的报道较多，食品中多为发酵制品，如白酒[3]、酸奶[4-5]、乳酸饮料[5]、泡菜[6]等，药品中有醋酸奥曲肽注射剂[7]、左氧氟沙星[8]、乳酸菌素原料制剂[9]等，关于L-乳酸、D-乳酸的测定，已经建立的分析方法主要有4种:滴定法、旋光法、UV 酶法分析、酶电极法和液相色谱法[10]。

短链脂肪酸通常是指碳链中碳原子数少于6 的有机脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸等[11]。短链脂肪酸是乳酸发酵的代谢物之一，能改善一些金属离子如钙、铁、镁的代谢和吸收，对胃黏膜有一定的保护作用，也能改善乳制品的风味[12-13]。短链脂肪酸被吸收后，在各种器官中被利用，在调节内源性代谢方面起重要作用[14]。目前，气质联用法用于检测短链脂肪酸较为广泛，曾鳞粞[15]用GC-MS 分别对生物组织、粪便、血液等对短链脂肪酸进行了分析，庞锦伟等[16]用GC-MS 对酵素产品中的5种短链脂肪酸进行了测定。乳酸菌素原料是由嗜酸乳杆菌发酵脱脂奶粉而成的粉末，其中乳酸及短链脂肪酸是主要代谢产物。现行质量标准水平较低，质量控制方法简单，其中总酸量通过酸碱滴定法测定，没有较为详细的指标性成分。本实验参考白璧炜的检测方法[9]及国标方法[17],采用高效液相色谱法对乳酸菌素原料中的L-乳酸、D-乳酸进行分离与测定，采用气质联用法[18-20]对原料中的7 种短链脂肪酸进行测定，用较为先进的技术对原料进行质量分析，为选择原料提供科学的参考依据。

1 材料与设备

1.1 样品与试剂

乳酸菌素原料，分别由A、B、C 原料厂家提供；L-乳酸对照品（≥98%）、D-乳酸对照品（≥90%），德国默克生命科学有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸（均为色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；Agilent 7890A-7000D 气质联用仪，美国安捷伦科技有限公司；sartorius MS204S/01 电子天平，德国Sartorius 赛多利斯公司；sartorius MS6.6S-CE 电子天平，德国Sartorius赛多利斯公司；IQ 7000 超纯水仪，厦门精益兴业科技有限公司；KQ-1000KDE 超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；GL-20G-II 低温高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

2 方法与测定

2.1 L-乳酸与D-乳酸的测定

2.1.1 标准品溶液的制备

精密称取L-乳酸对照品26.540 mg，D-乳酸对照品25.060 mg，加流动相溶解并定容到25 mL，经稀释并折算制成系列浓度的标准溶液，L-乳酸的对照品浓度分别为0.212、0.425、0.637、0.849、1.062 mg/mL，D-乳酸对照品浓度分别为 0.200、0.401、0.601、0.802、1.002 mg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取乳酸菌素原料粉末约0.6 g，精密称定，置于100 mL 容量瓶中，加入少量流动相溶解，超声处理15 min, 放冷，加溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 色谱条件

色谱柱：手性柱Chirex 3126 (D)-penicillamine（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：35 ℃ ；流动相：2 mmol/L 硫酸铜溶液（溶剂为5%异丙醇）；流速：1.000 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

2.1.4 定性与定量

将相同色谱条件下的样品色谱图与乳酸标准液色谱图进行对照，根据保留时间对样品中的L-乳酸、D-乳酸进行定性。用外标法定量，计算出样品中L-乳酸和D-乳酸的含量。

2.2 短链脂肪酸的测定

2.2.1 标准品溶液的制备

先配制高浓度混标，逐级稀释成9.5、8、2、1、0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.02、0.005 μg/mL,然后加入内标。

2.2.2 供试品溶液的制备

（1）称取样本 20 mg 于 2 mL EP 管中，加入 1 mL磷酸（0.5% v/v）溶液涡旋10 min混匀，超声5 min。

（2）取0.1 mL 上述样品匀液加入到1.5 mL 离心管中，加入0.5 mL MTBE（含内标）溶液，涡旋3 min，超声5 min；

（3）12 000 r/min、4℃条件下离心10 min，离心后吸取上层清液0.2 mL于进样瓶，待GC-MS/MS分析；

2.2.3 色谱条件

色谱柱:DB-FFAP (30m×0.25mm×0.25 μm)；进样量：3 μL；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；分流模式：2∶1；升温程序：95 ℃保持1min，以25 ℃/min 的速度升至 100 ℃ ，以 17 ℃/min 的速度升至 130 ℃ ，保持0.4 min，以 25 ℃/min 的速度升至 200 ℃ ，保持0.5 min；扫描模式：MRM；四级杆温度：150° C；前进样口温度：200 °C；传输线温度：230 °C；离子源温度：230 °C；电离电压：70eV。

3 结果与讨论

3.1 L-乳酸与D-乳酸检测的方法学验证

3.1.1 线性与范围

取“2.1.1”项下不同浓度的L-乳酸对照品溶液、D-乳酸对照品溶液，分别精密量取10 μL 注入液相色谱仪峰面积，以对照品峰面积为横坐标(X)，进样浓度为纵坐标（Y）进行线性回归，得到回归方程。

L-乳酸：y=0.0146x+0.0135(R2=0.9998)；线性范围0.2123～1.0616 mg/mL

D-乳酸：y=0.0147x-0.0036(R2=0.9997)；线性范围0.2005～1.0024 mg/mL

3.1.2 重复性试验

精密称取乳酸菌素原料的同一批样品6 份，每份约0.6 g，按“2.1.2”项下制备供试品方法平行制备，通过进样检测，根据峰面积与回归方程计算含量。

L-乳酸的平均含量为44.2359 mg/g，RSD 值为1.48；D-乳酸的平均含量为 35.5082 mg/g，RSD 值为0.73。

图1 L-乳酸、D-乳酸的重复性色谱图

3.1.3 稳定性试验

精密吸取乳酸菌素原料的同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、12、16、24 h 进样检测，根据峰面积考察样品稳定性。L-乳酸的RSD 值为1.32%，D-乳酸的RSD 值为1.21%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

图2 L-乳酸、D-乳酸的稳定性色谱图

3.1.4 加样回收试验

精密称取乳酸菌素原料的同一批样品6 份，每份称约0.10 g，至于25 mL 容量瓶中，同时各移取10 mL同一浓度的对照品溶液（L-乳酸0.8043 mg/mL、D-乳酸0.7172 mg/mL）至容量瓶中，按“2.1.2”项下供试品制备方法平行制备，通过进样检测，根据峰面积与回归方程计算其含量。

L-乳酸的平均回收率为98.90%，D-乳酸的平均回收率为100.26%，RSD 值分别为1.89、1.44。

3.2 不同厂家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量测定

按“2.1.2”项下供试品制备方法平行制备，对3 个不同厂家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量进行检测。

表1 不同厂家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量 mg/g

由表中结果可知，不同厂家的乳酸菌素原料中，L-乳酸与D-乳酸的含量有明显差别，两者比值均大于1。其中厂家C 的L-乳酸含量最高，厂家B 的居中,而厂家A 的含量最低,就L-乳酸含量进行排序为C＞B＞A。

3.3 短链脂肪酸标准品的测定

3.3.1 短链脂肪酸混标总离子流图

7 种短链脂肪酸混合标液GC-MS 总离子流色谱如图3。

表2 7种短链脂肪酸的出峰时间及线性关系结果

图3 7种短链脂肪酸混合标液GC-MS总离子流色谱图

3.3.2 短链脂肪酸线性关系

7种短链脂肪酸线性关系如表2。

3.4 不同厂家乳酸菌素原料中短链脂肪酸的含量测定

按“2.2.2”项下供试品制备方法制备样品，对3 个不同厂家乳酸菌素原料中7 种短链脂肪酸的含量进行检测。

表3 不同厂家乳酸菌素原料中短链脂肪酸的含量 μg/g

3.5 不同厂家乳酸菌素原料中短链脂肪酸主成分分析

采用SPSS 21.0 软件，将三个厂家乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、7 种短链脂肪酸总量等8 个指标转换成2 个主成分，这2 个主成分提供了100%的信息，且是综合的，相互独立的指标，因此可用这2 个主成分对各样品进行综合评价，结果如表4 所示，前2 个主成分的累积贡献率为达100%，因此选定前2个主成分来概括样品信息。

表4 特征值、方差贡献及累积贡献率

表5 是描述各因素对主成分贡献的主成分系数向量，对主成分1 贡献最大的是异戊酸、丙酸、戊酸、异丁酸、丁酸，对主成分2 贡献最大的是7 种有机酸总量、乙酸、己酸、丁酸、异丁酸。

以 2 个主成分 F1、F2与其贡献率构建出三个厂家短链脂肪酸的综合评价模型 F，F 是主成分 F1、F2的线性组合，即：F=72.047F1+27.953F2。

利用数学模型对三个厂家短链脂肪酸进行综合评价，结果见表6。排名为C＞B＞A。

4 讨论

本研究参考高效液相色谱法[9、12]及气质联用法[13-15]分别对乳酸菌素原料中的L-乳酸与D-乳酸及乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸等7 种短链脂肪酸进行了含量测定，并对短链脂肪酸结果进行了主成分分析。最终结合L-乳酸、7 种短链脂肪酸含量，判定三个厂家乳酸菌素原料质量为C＞B＞A。实验结果表明，本研究所用方法准确、可靠，可作为乳酸菌素原料质量控制的方法之一。