非编码RNA GlmY对伤寒沙门菌生物膜形成的影响

李雪，赵昕，靳梦彤，唐浩，张盈，黄新祥

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 南京市第一医院核医学科，江苏 南京 210006)

伤寒沙门菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S. Typhi)是一种以人类为唯一宿主的肠道致病菌，主要通过受污染的食物或水经消化道入侵人体，突破免疫防御引起全身性感染(伤寒)[1- 2]。S. Typhi可黏附在某些非生物固体甚至人体胆石表面，形成大量高度组织化、系统化的细菌群落——生物膜，该膜结构的形成能够使细菌抵抗环境压力和抗生素，并逃避宿主免疫系统的攻击，增强其在宿主体外的传播持久性及体内定植[3]。生物膜的形成受到庞大而复杂的调控网络控制，包括许多转录和转录后调控因子，例如双组分调节体系，σ因子和非编码RNA等[4- 5]。

RNA不具有编码功能，广泛存在于各种微生物及动植物。多种细菌中均已鉴定出多种具有调控作用的非编码RNA(ncRNA)[6]，它们大多通过与对侧或远端靶mRNA形成完全或不完全碱基配对的方式来发挥作用[7-8]。本课题组前期利用RNA-seq技术对生物膜及浮游状态的S. Typhi进行转录组分析，发现ncRNA GlmY在生物膜中的表达水平明显高于浮游菌(尚未发表)。GlmY可与ncRNA GlmZ 协同作用来调节胞内葡萄糖胺-6-磷酸的含量[9],但其在细菌生物膜形成中的作用尚未可知，因此本研究拟探讨GlmY对S. Typhi生物膜形成的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

伤寒沙门菌野生株S. Typhi GIFU10007、E.coliλ372和自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠；E.coliDH5α、glmY缺陷株、回补株、空质粒对照株由本实验室制备或保存；pBAD/myc-HisA为美国Promega公司产品。

1.2 主要试剂与仪器

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉(德国Oxoid公司)；限制性核酸内切酶BamH Ⅰ，T4DNA连接酶(大连TaKaRa公司)；Trizol、氯仿(美国Sigma公司)；超保真DNA聚合酶、逆转录试剂、SYBR荧光定量试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；96孔圆底细胞培养板(美国Corning公司)。凝胶成像仪(美国Gene Genius Bio Imaging System)；核酸紫外检测仪(德国Eppendorf公司)；PCR仪(美国Applied Biosystems®2720)；cfx96荧光定量PCR仪，电转化仪均为美国Bio-Rad公司产品。设计各种引物，具体见表1，下划线为酶切位点/接头序列。引物由苏州泓讯生物科技有限公司合成。

1.3 glmY缺陷株构建

S. TyphiglmY缺陷株依照参考文献方法构建[10]，分别设计glmY上下游特异性引物P1A/P1B、P2A/P2B，以S. Typhi 野生株DNA为模板，用重叠PCR获得重组片段，并插入自杀质粒 pGMB151BamH Ⅰ位点，将重组质粒电转导入S. Typhi野生株，经5%蔗糖板传代培养筛选，获得稳定重组的glmY缺陷株。

表1 引物序列

1.4 细菌生物膜形成检测

细菌生物膜形成实验参考文献[11]，分别将野生株和glmY缺陷株接种于20 mL胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基培养至D(600 nm)=0.4。离心收集菌体，用TSB重悬并转种入96孔U型底细胞培养板，30℃静置培养96 h。实验行3次生物学重复。

1.5 细菌总RNA提取及qRT-PCR检测

细菌总RNA提取及qRT-PCR依照参考文献[11]，分别挑取待测菌株的单菌落以“1.4”中方法培养至D(600 nm)=0.4，离心收集菌体，Trizol法提取总RNA并消化基因组DNA。取2 μg总RNA用特异性或随机引物进行逆转录。将野生株基因组DNA梯度稀释(至少5个梯度)制作各待测基因qRT-PCR的标准曲线，同时，将逆转录产物适当稀释后作为模板，用qRT-PCR检测待测基因和内参基因16 S mRNA水平。实验行3次生物学重复。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 成功制备glmY缺陷变异株

为制备glmY缺陷变异株，采用自杀质粒同源重组的方法来敲除目的基因。以S. Typhi野生株基因组DNA为模板，经PCR扩增获得glmY上、下游同源片段F1(423 bp)、F2(435 bp)，如图1A。利用重叠PCR获得F1+F2定向连接产物作为重组DNA片段(图1B)，连接自杀质粒，热击导入E.coliλ372感受态细胞。提取经PCR及序列分析验证后的阳性克隆重组质粒，电击转入S. Typhi野生株中，用蔗糖诱导重组，PCR 扩增glmY筛选菌株，最后获得传代稳定的glmY缺失变异株(图1C)。

M: DL2000 DNA标准参照物；A：PCR扩增同源片段；1，同源片段F1；2，同源片段F2；B：重叠PCR扩增同源片段；1，阴性对照；2，F1+F2定向连接产物；C：PCR筛选重组菌株；S，阳性对照；L，阴性对照；1～8，稳定变异株的PCR扩增结果

2.2 GlmY可增强伤寒沙门菌生物膜形成能力

结晶紫染色结果如图2所示，与野生株相比，缺陷株的生物膜染色形成明显降低(t=25.57，P<0.01)，表明GlmY缺失可减弱S. Typhi野生株的生物膜形成能力。

图2 S. Typhi生物膜形成分析

2.3 GlmY影响生物膜相关基因表达水平

为进一步探究GlmY通过何种调控途径来影响生物膜形成，本研究选取11个生物膜形成要素的相关基因(菌毛：csgD、csgA、fimA；胞外多糖：yihP、rfaD、wcaA；鞭毛：flhD、fliA、fljB；纤维素：bcsA；表面蛋白：bapA)，并用qRT-PCR检测野生株和缺陷株中上述基因的mRNA水平。如图3所示，与野生株相比，缺陷株中csgD和csgA的mRNA水平明显下降(P<0.01或<0.05)，同时缺陷株中胞外多糖相关基因yihP、rfaD、wcaA及纤维素相关基因bcsA的mRNA表达均有不同程度的上调(P均<0.05或<0.01)，其余相关基因mRNA表达差异无统计学意义(P均>0.05)。

图3 野生株与glmY缺陷株生物膜形成相关基因mRNA相对表达水平

3 讨论

为探究在S. Typhi生物膜形成中具有调控作用的ncRNA，本课题组前期利用Solexa高通量测序技术对不同状态下的S. Typhi进行转录组分析，发现生物膜状态下的S. Typhi ncRNA GlmY表达水平较高。研究发现，ncRNA GlmY可协同ncRNA GlmZ促进GlmS翻译[9,12]。glmS基因编码的谷氨酰胺合酶为细菌合成细胞壁主要成分N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸所必需。本研究在成功构建glmY缺陷株基础上进行生物膜形成试验，发现glmY缺陷株生物膜形成能力明显低于野生株。同时，发现GlmY缺失可下调卷曲菌毛合成相关基因csgD和csgA的mRNA水平，但上调胞外多糖和纤维素合成相关基因的mRNA水平，推测GlmY对卷曲菌毛、胞外多糖及纤维素的合成均有调控作用，但以前者的作用为主。由此揭示GlmY有可能通过促进S. Typhi的卷曲菌毛合成进而调节生物膜形成。

已知卷曲菌毛是S. Typhi生物膜的主要蛋白成分[13]，CsgD作为卷曲菌毛合成中的关键转录调节因子，不仅负责调控csgBA操纵子(编码主结构蛋白CsgA和成核蛋白质CsgB)和csgDEFG操纵子(编码纤维组装和分泌所需的蛋白质)的表达[14-15]，同时csgD转录本还是生物膜调控网络的信号枢纽，受到许多小的ncRNA调控。如OmrA，OmrB，McaS，RprA，GcvB等这些已知的小RNA均可通过与csgDmRNA直接结合或间接作用来促进或者抑制csgD表达[16-18]。本研究虽然发现GlmY可下调csgD和csgA的mRNA水平，但并未确定二者是否为GlmY的新靶标。此外，GlmY缺失后，有部分与生物膜形成相关的基因的mRNA表达呈上升趋势，其作用及机制有待进一步研究。