哮喘小鼠脾细胞中粒细胞型髓源性抑制细胞和Th17细胞水平的变化

薛菲，余孟珠，单文琪，卢红艳，汪雪峰

(江苏大学附属医院 1. 儿科; 2. 中心实验室，江苏 镇江 212001)

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病。目前公认的机制是由于辅助性T细胞(help T cell，Th)失衡所导致的，其中Th1降低、Th2增高而引起Th1/Th2失衡，Th2可激活B细胞产生免疫球蛋白 E(immunoglobulin E，IgE)并介导嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞等诱发Ⅱ型超敏反应和气道炎症。此外，Th17/调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)失衡在哮喘的发生发展中起着重要作用[1]。由于哮喘机制复杂，目前尚不清楚Th17/Treg失衡是如何参与哮喘的发生发展。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是由不成熟的髓系细胞组成的异质性细胞群[2]。MDSCs在小鼠中可被分为两个亚群，分别为粒细胞型MDSCs(granulocytic MDSCs，G-MDSCs)，表型为CD11b+Ly6G+Ly6Clow及单核细胞型MDSCs (monocytic MDSCs，M-MDSCs)，其表型为CD11b+Ly6G-Ly6Chigh[3]。本课题组前期研究发现哮喘患儿外周血中的MDSCs与Th17呈正相关[4]。本研究分析Th17、Treg及MDSCs细胞在实验性哮喘小鼠脾细胞中水平的变化及肺组织中相关细胞因子的表达情况，从而初步探索其在哮喘发生发展中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

6～8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠(18～20 g)购自扬州大学比较医学中心，许可证号为SCXK(苏)2017- 0007，在江苏大学动物实验中心SPF级饲养。Ⅱ级和Ⅴ级卵清蛋白(ovalbumin，OVA)均为美国Sigma公司产品；山羊抗小鼠IgE、免疫组化IL-17抗体(英国Abcam公司)；抗山羊第二抗体和PMA/Ionomycin及BFA/Monensin购于中国联科生物；流式抗体FITC-CD11b、APC-Ly6G、PE-Ly6C、PE-IL-17、免疫组化骨髓分化抗原(Gr-1)抗体(美国BioLegend公司)；FITC-CD4、免疫组化叉头样转录因子3(Foxp3)抗体，破膜固定液(美国eBioscience公司)；小鼠Treg试剂盒(美国Thermo公司)。

1.2 哮喘小鼠模型建立

将小鼠随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)组和模型组，每组6只。在1、8、15天，PBS组腹腔注射PBS，同时模型组腹腔注射100 μgⅤ级卵清蛋白和10%氢氧化铝凝胶(自配)悬液，第22～28天每天雾化吸入2%Ⅱ级卵清蛋白溶液，每次1 h。最后一次雾化24 h后取眼球血，然后处死小鼠。

1.3 ELISA法检测血清OVA特异性IgE

小鼠采血后，4 000 r/min离心25 min收集上清液，包被4℃过夜，用5%牛奶封闭，加样，孵山羊抗小鼠IgE抗体(1 ∶250)，37℃温育2 h，TBST洗板5次，再孵抗山羊二抗(1 ∶5 000)，37℃温育1 h，TBST洗板5次，加入TMB显色液，37℃温育20 min，加入终止液50 μL，显色终止后，在450 nm波长检测光密度(D)值。

1.4 HE染色及PAS染色检测肺组织病理变化

将左肺在10%的甲醛溶液中固定，然后用石蜡包埋，将包被组织切4 μm厚做HE染色及PAS染色，在光学显微镜下观察肺组织气道变化。HE染色步骤如下：将石蜡切片脱蜡至水后，分别用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脱蜡2遍，每遍15 min；用等比例二甲苯和无水乙醇浸泡2 min后用无水乙醇清洗2遍，每遍5 min；使用80%乙醇脱水5 min再用蒸馏水洗5 min；用苏木素液染色5 min后流水冲洗5 min；用1%盐酸乙醇冲洗30 s后，再置入1%的伊红染液中浸泡30 s，随后再次清洗；切片分别置于 95%、95%、100%、100%的乙醇中脱水，各1 min，后放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ中透明，各3 min；最后用中性树脂封片。PAS染色步骤如下：将石蜡切片脱蜡至水后滴加高碘酸溶液染色15 min，浸入大量自来水中冲洗5 min；浸入蒸馏水洗2次，擦干切片上的多余水分；滴加Schiff氏液10 min，流水冲洗5 min，滴加苏木素染液3 min，流水冲洗5 min；常规脱水、透明、用中性树脂封片。

1.5 流式细胞术检测脾细胞中Th17、Treg、MDSCs细胞的比例

脾脏研磨去除红细胞后，取1×106细胞做流式细胞术。MDSC标记抗-CD11b、抗-Ly-6G、抗-Ly-6C；Treg细胞按照试剂盒说明书步骤进行染色；Th17在使用PMA/Ionomycin和BFA/Monensin激发5 h后，加入抗-CD4孵育30 min后使用破膜固定液破膜30 min，再使用抗IL-17孵育30 min后用PBS洗去未结合抗体，用4%的多聚甲醛固定，然后使用流式细胞分析仪(美国BD公司)进行细胞检测并用Flowjo v10.0.7软件分析实验数据。

1.6 免疫组织化学染色检测肺组织Gr-1、IL-17和Foxp3的表达

将石蜡切片脱蜡至水，使用枸橼酸热修复，冷却至室温，用PBS洗3次，加3%过氧化氢，室温孵育10 min，用PBS洗3次，加抗Gr-1、IL-17、Foxp3抗体，4℃过夜，PBS洗3次，滴加快捷型酶标羊抗鼠/兔二抗，室温孵育20 min，PBS洗3次。滴加DAB溶液(需现配现用)，显微镜下观察3～4 min后自来水冲洗，使用苏木素复染，PBS反蓝。常规脱水、透明、用中性树脂封片。最后在光学显微镜下观察两组小鼠肺组织的浸润情况，其中浅黄色为弱阳性细胞，棕黄色为阳性细胞，并用Image Pro Plus 6.0进行半定量分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 哮喘模型成功建立

HE染色结果显示，与PBS组相比，模型组小鼠气道周围可见大量炎性细胞明显浸润，气管壁增厚，管腔不规则；在PAS染色中，模型组小鼠肺组织杯状细胞及黏液分泌明显增多。同时模型组小鼠血清中IgE含量显著升高(t=11.08，P<0.001)。见图1。结果表明成功建立了小鼠哮喘模型。

图1 小鼠肺组织HE、PAS染色(×400)及血清IgE水平

2.2 哮喘小鼠脾细胞中Th17比例增加而Treg细胞比例减少

用流式细胞术检测小鼠脾细胞中CD4+IL-17+Th17细胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞结果显示，哮喘模型小鼠脾细胞中Th17细胞的比例较PBS组显著增加(t=5.685，P<0.01)，Treg细胞的比例显著下降(t=5.596，P<0.01)。见图2。

图2 流式细胞术检测小鼠脾细胞中Th17及Treg细胞比例

2.3 哮喘小鼠脾细胞中的G-MDSCs比例增加

流式细胞术检测小鼠脾细胞中的MDSCs的两个亚群结果显示，与PBS组相比，哮喘模型组小鼠脾细胞中CD11b+Ly6G-Ly6Chigh的M-MDSCs比例无显著差异(t=0.691 6，P>0.05)，但CD11b+Ly6G+Ly6Clow的G-MDSCs显著增高(t=4.404，P<0.01)。见图3。

图3 小鼠脾细胞中M-MDSCs及G-MDSCs比例

2.4 哮喘小鼠肺组织中Gr-1、IL-17表达上调而Foxp3表达下调

免疫组化染色结果显示，Gr-1定位于气道上皮细胞及炎症细胞的细胞膜和细胞质，IL-17主要定位于细胞膜和细胞质，Foxp3主要定位于细胞质。如图4所示，半定量分析结果显示模型组小鼠肺中Gr-1(t=4.552，P<0.01)和IL-17(t=3.76，P<0.01)表达明显上调，而Foxp3表达明显下调(t=3.508，P<0.01)。

图4 小鼠肺组织Gr-1、IL-17及 Foxp3的表达(免疫组化×400)

3 讨论

在过去的几十年里，中国儿童的哮喘患病率有所上升[5]，但迄今为止其发病机制尚不明确。本研究通过建立哮喘小鼠模型，探讨 Th17、Treg、MDSCs细胞在哮喘发病中的作用。结果表明，哮喘小鼠血清IgE水平升高，HE染色及PAS染色均能发现模型组的气道炎性细胞浸润明显，气管壁增厚，管腔不规则，黏液分泌增加。这表明本实验中哮喘小鼠模型成功建立。

近些年来，Th17/Treg细胞平衡与哮喘的关系引起研究者的广泛关注。研究发现在一些哮喘小鼠模型和其他疾病的模型中[6]，Th17/Treg细胞是失衡的，Th17细胞的高表达主要表现是其分泌的细胞因子IL-17高表达[7]，而Foxp3+Treg细胞表达降低。Treg细胞是目前已知的具有免疫抑制作用的免疫细胞，在免疫耐受上具有重要作用。而Th17/Treg平衡对维持机体稳定具有一定的调节作用[8]。

与上述研究结果相一致，本研究中哮喘小鼠脾细胞中的Th17细胞比例增加，而Treg细胞比例降低。目前MDSCs细胞是研究肿瘤免疫的热点，MDSCs能调节T细胞反应[9]。而在一些自身免疫性疾病的研究中发现，MDSCs与T细胞关系密切。在实验性自身免疫性脑脊髓炎的多发硬化的小鼠模型中发现，脾源性MDSCs虽然会抑制T细胞功能，但同时可以促进Th17的分化、增殖[10]。Wu等[11]发现系统性红斑狼疮患者血清中的MDSCs与Th17水平及病情的严重程度呈正相关；而且系统性红斑狼疮患者的MDSCs在体外能促进Th17的分化。类风湿关节炎患者外周循环和淋巴组织中MDSCs数量增加，且与Th17细胞呈正相关，关节炎小鼠和类风湿关节炎患者体内分离的MDSCs均可促进Th17细胞的分化[12]。张艳丽等[13]研究发现，哮喘患者外周血中的MDSCs明显高于肺炎患者和健康者。本课题组前期研究也发现，哮喘患儿体内MDSCs与Th17细胞呈正相关，哮喘小鼠中G-MDSCs、Arg1mRNA的表达增加[14]。本研究也证实哮喘小鼠脾细胞中G-MDSCs比例增加。但是否哮喘小鼠中高表达的G-MDSCs细胞可促进Th17细胞的分化，尚需要进一步研究。

因为哮喘小鼠的炎症部位是肺脏，我们进一步应用免疫组化染色检测了小鼠肺组织中Gr-1、IL-17和Foxp3蛋白的表达。其中Gr-1也被称为Ly6G/Ly6C，是G-MDSCs的标志[15]；IL-17是Th17细胞的主要细胞因子；Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞的关键转录因子。结果显示与Th17、Treg、G-MDSCs细胞在脾细胞中比例趋势一致，哮喘小鼠肺组织中高表达Gr-1、IL-17，低表达Foxp3，提示哮喘小鼠的脾细胞及局部炎症部位Th17、G-MDSCs细胞增加，同时 Treg细胞减少。

综上所述，哮喘小鼠脾细胞及肺组织中G-MDSCs、Th17细胞比例增加，Treg细胞减少，三者可能共同参与哮喘小鼠气道炎症反应。