牛源肺炎克雷伯菌菌毛类型鉴定及fimA、mrkA基因序列分析

聂青青，张 璇，黄 攀，单文杰

（1.赣州职业技术学院，江西赣州 341000；2.垫江县市政服务中心，重庆 408300；3.巴南区人民政府莲花街道农业服务中心，重庆 401321；4.共青城市农业农村水利局，江西九江 332020）

肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae）属肠杆菌科（Enterobaeteriaceae）、克雷伯菌属（Klebsiella），为革兰氏阴性短杆菌，是1种人畜共患病病原，也是引起多种动物患病的条件性致病菌，可引起肺炎、败血症、化脓性感染、支气管炎、尿路感染及脑膜炎等[1-3]。现有研究表明，菌毛是肺炎克雷伯菌的1种主要的毒力因子[4-5]。在感染过程中，细菌通过菌毛接近宿主黏膜表面或者吸附于宿主细胞，进而使机体致病[6]。肺炎克雷伯菌的菌毛可分为Ⅰ型和Ⅲ型菌毛[7]。Ⅰ型菌毛属于甘露糖敏感性（mannose-sensitive hemagglutination，MSHA）菌毛，即甘露糖存在时会阻断菌毛与红细胞的凝集现象，主要附着于尿道上皮细胞；Ⅲ型菌毛具有甘露糖抵抗血凝特性（mannose-resistant hemagglutination，MRHA），又称为甘露糖抵抗血凝特性菌毛，主要附着于呼吸道上皮细胞[8]。上述两种菌毛的主要结构亚单位基因为fimA和mrkA[9]。Ⅰ型菌毛由一组fim（B、E、A、I、C、D、F、G、H）基因群所表达，fimA是负责表达Ⅰ型菌毛柄的结构基因；Ⅲ型菌毛由一组mrk（E、A、B、C、D、F）基因群所表达，mrkA是负责表达Ⅲ型菌毛柄的结构基因。

本研究对近年在重庆、四川部分肉牛场分离到的20株肺炎克雷伯菌进行了MSHA/MRHA试验，鉴定其菌毛类型，并对20株菌的fimA基因和mrkA基因进行了测序及氨基酸序列分析。研究旨在揭示川渝地区克雷伯菌菌毛类型与fimA基因和mrkA基因的变异特点，为深入研究其致病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

通过棉拭子的方法采集重庆、四川部分肉牛场的牛上呼吸道黏液，分离细菌；通过生化试验、16S rRNA鉴定出20株肺炎克雷伯菌，分别编号为K.pn1～K.pn20，其中K.pn4、K.pn11、K.pn20分离自四川，其余分离自重庆。SPF豚鼠购自重庆市中药研究院。

1.2 试剂与培养基

D-甘露糖（上海国药集团化学试剂有限公司）、DNA回收试剂盒（广州飞扬生化有限公司）、PCR试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）；小剂量DNA提取试剂盒、DL2000DNA Marker（生工生物工程（上海）有限公司）；改良Minka液体培养基、2%豚鼠红细胞悬液等。

1.3 主要仪器

AR1140/C电子分析天平（上海奥豪斯公司）、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械）、DYY-6C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、S10000PCR仪（Thermal Cycler）、TGL-16高速冷冻离心机等。

1.4 MSHA/MRHA试验

按照参考文献[10]进行。将各菌株分别经改良Minka液体培养基37℃静置培养48 h，同样培养条件下连续传代3次，即为菌毛化菌体。菌毛化菌体制成约50亿CFU/mL细菌悬液，每株菌分为不加D-甘露糖和加D-甘露糖（终浓度为0.5%）的两个样本，加入等量2%豚鼠红细胞悬液，设生理盐水空白对照；振荡后4℃保存2 h，观察血球凝集反应和D-甘露糖是否抑制凝集。将甘露糖抵抗血凝试验阳性的菌株，4℃条件下完全凝集，37℃静置30 min，检查凝集现象是否被解脱。凝集解脱后，重新混匀4℃保存1.5 h，观察是否再现凝集反应。能够凝集豚鼠红细胞的菌株可判定MSHA反应阳性；若37℃出现解脱，4℃又重现凝集反应，可判定为MRHA反应阳性。

1.5 fimA和mrkA基因的PCR扩增、测序

20株菌毛化菌体经麦康凯培养基培养后，核酸提取试剂盒提取其DNA，PCR扩增fimA和mrkA基因序列，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

PCR反应体系（25μL）：上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、ddH2O 9.5μL、DNA模板2μL、2×mix DNA聚合酶预混液12.5μL。

PCR反应条件：94℃5 min；94℃30 s，56.5℃30 s，72℃40 s，30个循环；72℃10 min。

Ⅰ型菌毛菌株的PCR反应体系与Ⅲ型相同，但反应条件为：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃35 s，30个PCR循环；72℃10 min。

反应结束后取5.0μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。DNA回收试剂盒对目的片段进行回收与纯化，由上海生物工程有限公司测序。

1.6 序列分析

测序结果利用MEGA软件与GenBank中登录的fimA和mrkA基因序列进行同源性比较，绘制系统进化树。同时将基因翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列分析。

2 结果与分析

2.1肺炎克雷伯菌MSHA/MRHA试验结果（见图1）

由图1可知，将20株菌毛化肺炎克雷伯菌进行MSHA/MRHA试验后，结果显示，有5株菌株不能抵抗D-甘露糖的抑制作用，其余均能够抵抗D-甘露糖的抑制作用，且在37℃下均可被解脱，在4℃下重现完全凝集，符合MRHA阳性判定标准，阴性对照组无自凝现象。

上述结果表明，该20株肺炎克雷伯菌中产生Ⅰ型菌毛的有5株，为：K.pn16～K.pn20；产生Ⅲ型菌毛的有15株，为：K.pn1～K.pn15。

2.2 肺炎克雷伯菌基因的PCR鉴定（见图2、图3）

由图2、图3可知，20株供试菌株中，有5株菌针对Ⅰ型菌毛主要结构亚单位基因（fimA）序列的引物扩增出549 bp的目的片段；15株菌针对Ⅲ型菌毛的主要结构亚单位基因（mrkA）序列的引物扩增出609 bp的目的片段，与预期的大小相符，且PCR鉴定结果的肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株和Ⅲ型菌毛菌株与MSHA/MRHA试验结果相符。

2.3 序列同源性及系统进化树分析（见图4）

研究中的5株fimA基因和15株mrkA基因与GenBank中登录的fimA和mrkA基因序列进行同源性比较，并构建系统进化树。结果显示，fimA基因核苷酸序列的同源性为82.6%～98.9%，推导氨基酸序列同源性为90.9%～97.7%，mrkA基因核苷酸序列的同源性为80.7%～99.7%，推导氨基酸序列同源性84.1%～100%。5个fimA基因与代表株NZ_CP009461.1的核苷酸序列同源性为83.1%～99.0%，推导氨基酸序列同源性为90.3%～97.7%；15个mrkA基因与代表株AOGO01000023.1的核苷酸序列同源性80.7%～99.7%，推导氨基酸序列同源性为84.1%～100.0%。

由图4可知，分离株菌毛类型有Ⅰ型和Ⅲ型，Ⅰ型菌毛共5株，Ⅲ型菌毛菌株居多（15株）。

Ⅲ型菌毛菌株可分为4个分支，其中6个分离株（K.pn1～K.pn6）与AOGO01000023.1株同属一个分支。

2.4 重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌氨基酸突变位点比对分析（见表2、表3）

由表2可知，测序的5个fimA氨基酸序列（菌毛类型均为Ⅰ型）与代表株NZ_CP009461.1比较，可分为2个分支，K.pn20与K.pn19为同一支，均仅在95位氨基酸位点存在特异性变异。K.pn16、K.pn17和K.pn18存在12个氨基酸差异，K.pn16和K.pn17均在19、95、97、101、104、118、129、133、142、151、170位氨基酸位点存在特异性变异，K.pn18在19、74、95、97、118、129、151、170氨基酸位点存在特异性差异，并在74位出现特有的变异。

表2 重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌fimA氨基酸突变位点比对分析Tab.2 Comparative analysis of fimA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

由表3可知，测序的15个mrkA氨基酸序列（菌毛类型均为Ⅲ型）与代表株AOGO01000023.1比较，存在多个位点存在差异，分离株两分支间有32个氨基酸存在差异。其中K.pn3分离株在20位出现特有变异，K.pn12分离株在17位出现特有变异，K.pn10分离株在70、187位出现特有变异，K.pn11分离株在132、181、185位出现特有变异，K.pn15分离株在115、119、144、146、175位出现特有变异。

表3 重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突变位点比对分析Tab.3 Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

续表3 重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突变位点比对分析Tab.3（continue）Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

3 讨论

本研究通过MSHA/MRHA试验和PCR方法，鉴定出近年重庆、四川部分肉牛场的20株肺炎克雷伯菌的菌毛类型。其中有5株为Ⅰ型菌毛，占25%；15株为Ⅲ型菌毛，占75%。来自四川的3株菌株中的1株是Ⅰ型菌毛，2株是Ⅲ型菌毛。分离自重庆的17株，其中4株是Ⅰ型菌毛，占23.5%；13株属于Ⅲ型菌毛，占76.5%。本研究结果表明，重庆、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要产Ⅲ型菌毛，进行肺炎克雷伯菌感染的防控应该更重视Ⅲ型菌毛。

MSHA/MRHA试验法确定菌毛类型较烦琐、耗时。何礼洋等[11]、刘选梅等[12]报道，采用PCR方法可快速区分鉴别Ⅰ型、Ⅲ型菌毛肺炎克雷伯菌，与MSHA/MRHA试验相比更加敏感、快速、方便。本研究结果表明，运用PCR对菌毛进行分型，试验结果与MSHA/MRHA试验一致：MSHA/MRHA试验法鉴定出Ⅰ型菌毛的5株菌株均扩增出了约549 bp大小的特异片段，而MSHA/MRHA试验法鉴定出Ⅲ型菌毛的15株菌株均扩增出了约609 bp大小的特异片段。PCR法鉴定菌株菌毛类型可避免MSHA/MRHA试验的局限性，且更加快速、准确、方便。

进化树是描述生物体形成或进化顺序的拓扑树结构，一般由一系列节点和分支组成，节点间的连线代表物种之间的亲缘关系[13]。为阐明fimA基因在各Ⅰ型菌毛菌株间及mrkA基因在各Ⅲ型菌毛菌株的进化关系，采用邻接法作进化树构建。本试验结果显示，15株Ⅲ型菌毛的菌株可以分成4个分支，说明各区县间的肺炎克雷伯菌菌毛类型进化关系存在差异。

根据fimA和mrkA氨基酸序列比对结果显示，本研究菌株的fimA和mrkA氨基酸序列存在多处变异；与参考菌株比较，fimA中12处位点存在变异，marA中32处氨基酸位点存在变异。四川株的fimA氨基酸序列相对于重庆株变异较少，如菌株K.pn20仅在95位氨基酸位点存在变异；重庆株除K.pn19与K.pn20相同，仅在95位氨基酸位点存在变异，其余分离株存在8～11个氨基酸存在差异。mrkA氨基酸序列的分离株有32个氨基酸存在差异，K.pn1～K.pn9氨基酸变异少，发生氨基酸变异位点0～3之间，其余6株菌氨基酸变异8～18个。

氨基酸的变异不仅表示基因的多态性，还可能表示蛋白质的功能、菌株的致病性等特征发生变化。肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95发生了氨基酸替代并由亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸，K.pn16和K.pn17在aa19、aa118和aa142位点均由亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸，K.pn18在aa19和aa118由亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸。Ⅰ型菌毛黏附作用的关键在于疏水能力的大小[14]，排斥水分子的能力增加时细菌菌毛的黏附能力更强，宿主机体更易致病。Ⅲ型菌毛的表达与细菌表面疏水性、致病性相关[15]，当菌毛主要亚单位组成的疏水性氨基酸的比例增高时，Ⅲ型菌毛可提高肺炎克雷伯菌表面疏水性。

本研究中Ⅲ型菌毛菌株K.pn11～K.pn15中aa86、aa167、aa182均发生了氨基酸替代，mrkA氨基酸187个位点中28.13%的氨基酸由亲水性变为疏水性；因此，预测相应菌株的黏附能力可能增强，毒力更强。

4 结论

MSHA/MRHA试验法对本研究的20株肺炎克雷伯菌敏感性不高。通过PCR方法，鉴定出20株肺炎克雷伯菌中有5株为Ⅰ型菌毛，15株为Ⅲ型菌毛，重庆、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要产Ⅲ型菌毛，且各区县之间的肺炎克雷伯菌菌毛类型进化关系存在差异；分析fimA和mrkA氨基酸序列后发现，fimA中12处位点存在变异，mrkA中32处氨基酸位点存在变异，肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95发生了氨基酸替代并由亲水性氨基酸变为了疏水性氨基酸，Ⅲ型菌毛菌株K.pn7、K.pn8和K.pn9在164位氨基酸上均发生了S164A。因此，预测相应菌株的黏附能力可能增强，毒力更强。