胶束电动色谱柱上酶反应测定低分子量肝素的抗凝血活性

2020-09-18张明瑜康经武

色谱 2020年10期

张明瑜, 康经武

(生命有机化学国家重点实验室, 中国科学院上海有机化学研究所, 上海 200032)

肝素是临床上广泛使用的抗凝血药物。低分子量肝素(LMWHs)是普通肝素通过化学或酶解方法解聚得到的[1]。肝素与抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)结合后引起ATⅢ构象的改变,从而将ATⅢ抗凝血酶活性提高1 000倍[2]。与普通肝素相比,低分子量肝素的抗凝血因子10(FXa)与抗凝血酶比例增大,其药代动力学参数更易预测,半衰期较长,且副作用较小。因此,LMWHs逐渐取代了普通肝素成为临床抗凝血药物的首选[3]。对于某些特殊的患者,如孕妇、儿童、肾衰竭患者、肥胖症患者及肝素耐受患者,在使用LMWHs治疗时需要监测血液中药物的抗凝血活性[4]。

肝素抗凝活性的测定方法有很多种。传统方法是凝血实验,包括活化部分凝血时间测定实验(activated partial thromboplastin time, APTT)、活化凝血时间测定实验(activated clotting time, ACT)和凝血酶原时间测定实验(prothrombin time, PT)。这些方法在监测异常出血征兆及抗凝血治疗过程中发挥了重要作用。但是采用凝血实验测定肝素的抗凝活性时,不同实验室间测定的结果往往有较大偏差[5]。与之相比,基于分光光度法的生色底物法灵敏度高,且易于实现自动化,已成为临床测定LMWHs抗凝血活性的黄金标准[6]。虽然如此,但这个方法仍然有其局限性。不同批次的生化试剂间活性差异会导致检测结果出现偏差[7];在检测全血样品时,样品基质会影响分光光度法检测的灵敏度和准确性。此外,该方法所需样品量和试剂量相对较大,也增加了测试成本。Harris等[8,9]为了消除样品基质对测定的影响,发展了测定LMWHs抗凝血活性的荧光方法,显著提高了灵敏度。色谱可以将反应混合物分离后进行在线检测,是研究酶活及酶抑制剂筛选的强有力工具。2013年,我们课题组发展了体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)测定LMWHs的抗凝血活性[10]。这一方法实现了在线混合、反应、分离及检测的一体化和自动化,显著减少了样品量和试剂用量,提高了灵敏度。毛细管电泳(CE)是一种与HPLC互补的液相分离技术,其中胶束电动色谱(MEKC)是CE的一种分离模式。MEKC采用胶束电解质溶液,实现了毛细管电泳对电中性样品的分离分析。与HPLC相比,CE分离时间短,样品和试剂消耗量少,更容易实现自动化操作。

本工作的目的是发展胶束电动色谱结合柱上酶微反应的方法用于测定低分子量肝素(依诺肝素钠)的抗凝血活性。该方法以毛细管进样端作为微量的酶反应器,将依诺肝素钠、ATⅢ、FXa和生色肽底物(CPS)溶液依次进样,分别采用自由扩散、层流横向扩散及电压混合模式,实现反应物间的混合。待孵育反应结束后,直接进行电泳分离和检测。为避免缓冲溶液中十二烷基磺酸钠(SDS)对ATⅢ和FXa活性的影响,实验采用了部分填充胶束电动色谱模式。采用柱上酶反应不仅降低了样品和试剂的消耗量,还实现了检测的自动化。MEKC可以将酶反应产生的对硝基苯胺(p-NA)与样品中的其他物质分离,因此可以在对硝基苯胺的最大吸收波长(380 nm)下进行测定,提高了测试的灵敏度。为了保证方法的重复性和定量准确性,实验使用呋喃妥英(NF)作为内标。通过方法的验证,证明了该方法具有较好的重复性和准确度。

1 实验部分

1.1 试剂和材料

磷酸氢二钠·12H2O、氯化钠、二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na·2H2O)、聚乙二醇6000 (PEG 6000)、SDS和氢氧化钠(NaOH)均购自阿拉丁有限公司(上海)。盐酸购自上海第四试剂厂(江苏昆山)。依诺肝素钠标准品购自美国药典(USP); CPS(序列:CH3OCO-D-Val-Gly-Arg-para nitroaniline)、p-NA、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二甲亚砜(DMSO)和NF均购自Sigma-Aldrich公司(美国)。ATⅢ(1×25 IU)和FXa(10×71 nkat)购自Chromogenix公司(意大利)。甲醇(HPLC级)购自Fisher Scientific公司(美国)。两个批次的LMWHs(依诺肝素钠)分别来源于赛诺菲-安万特(Sanofi Aventis公司,法国)和杭州九源基因工程有限公司。

1.2 溶液的配制

分别配制2 mol/L Tris、2 mol/L NaCl、0.5 mol/L磷酸氢二钠、0.5 mol/L SDS、1 mol/L HCl、0.5 mol/L EDTA和10%(v/v)PEG 6000储备液。

使用上述储备液分别配备分离缓冲液(40 mmol/L磷酸盐缓冲液,其中含有25～45 mmol/L SDS, pH 7.4)、反应缓冲液(50 mmol/L Tris-H3PO4,含有150 mmol/L NaCl, pH 7.4)和用于产生横向扩散的Tris PEG 6000缓冲液(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl和0.1%PEG 6000, pH 7.4)。以上溶液均使用1 mol/L H3PO4调节pH值。

使用水-乙醇(90∶10, v/v)配制5 mmol/L对硝基苯胺储备液,使用DMSO-水(10∶90, v/v)配制0.1 mol/L呋喃妥英储备液。对硝基苯胺和呋喃妥英工作液在使用前由储备液稀释而得。抗凝血酶ATⅢ溶液溶解为5.0 IU/mL的储备液,然后使用含有PEG 6000的Tris缓冲液稀释为1.0 IU/mL的工作液。配置7.1 nkat/mL的凝血因子FXa溶液作为工作液。首先用水配制3 mmol/L的生色肽底物储备液,使用前用pH 7.4反应缓冲液稀释得到0.5 mmol/L的生色肽底物工作液。用水溶液配制1.0 IU/mL的依诺肝素钠标准溶液(S),然后按0.78的剂间比,用pH 7.4反应缓冲液分别稀释至0.087、0.111、0.143和0.183 IU/mL，分别用S1～S4表示。首先对供试品预估一个效价,按照标准品配制的方法,配制含量为0.087、0.111、0.143、0.183 IU/mL的依诺肝素钠工作溶液，分别用T1～T4表示。所有溶液均由超纯水配制(Millipore超纯水系统,Millipore公司,USA),配制好的溶液置于4 ℃冰箱储存,所有缓冲溶液在使用前用0.45 μm滤膜过滤。

1.3 CE分离条件

所有的CE实验均在配有UV检测器的P/ACE MDQ CE系统(Beckman Coulter公司,美国)上进行。熔融石英毛细管柱:50 μm i.d.、365 μm o.d.、总柱长30 cm、有效长度19.5 cm,购自邯郸鑫诺光纤色谱。新的毛细管柱用0.1 mol/L NaOH溶液活化30 min,再用超纯水和电泳缓冲液分别冲洗2 min。每一次分析前用0.1 mol/L NaOH、超纯水和电泳缓冲液分别冲洗2 min。毛细管柱温为25 ℃,分离电压为15 kV。除非另外说明,UV检测波长均为380 nm。

图 1 反应物在毛细管内的层流横向扩散混合示意图Fig. 1 Schematic presentation for mixing reactants inside the capillary by transverse diffusion of laminar flow a. two reactants are injected; b. apply a short-time injection with high pressure; c. let stand to mix the two reactants completely.

柱上酶反应进样步骤如下:(1)依次将依诺肝素钠待测溶液和ATⅢ溶液以压力140 Pa进样3 s,静置1 min使两种溶液通过自由扩散混合;(2)随后以压力140 Pa导入FXa溶液3 s,在200 Pa压力下进样含有PEG 6000的Tris缓冲液(pH 7.4)3 s,使FXa溶液以图1所示的层流横向扩散的方式与依诺肝素钠和ATⅢ复合物混合,静置1 min; (3)将CPS溶液以压力140 Pa进样15 s后,施加3 kV电压0.3 min,使FXa与ATⅢ进一步混合,静置4 min; (4)最后,在优化好的条件下分离检测,记录对硝基苯胺与内标NF的峰面积。值得注意的是,需要在方法中设定进样程序,使得每次进样后将毛细管柱进样端浸入水中洗去黏附的试剂,以预防各个试剂间的交叉污染。

2 结果与讨论

2.1 MEKC方法的建立和优化

在测定低分子量肝素抗凝血活性的方法中,将柱上酶反应与MEKC分离检测集成为一体。测定依诺肝素钠抗凝血活性的柱上酶反应方法是将毛细管柱端作为酶微反应器,依次导入依诺肝素钠、ATⅢ、FXa和CPS溶液,在柱内实现混合、反应、分离和检测一体化,最大限度地实现检测的自动化。由于生成的对硝基苯胺为电中性,只能通过MEKC进行分离测定。我们对MEKC方法进行了优化,发现采用30 cm总长的石英毛细管、含20 mmol/L SDS的40 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、分离电压15 kV、柱温20 ℃时,能够实现对硝基苯胺和内标的最佳分离。

2.2 在线酶反应进样顺序、混合方式和反应条件的选择

由于分离缓冲液中的SDS会影响酶的活性,实验在进样前后均进一段反应缓冲液(200 Pa×3 s)隔离酶反应器。为避免试剂的交叉污染,在进样程序中设定毛细管在每进一个试剂后在反应缓冲液瓶中浸洗,洗掉毛细管柱和电极上的试剂。在肝素类药物抗凝血活性测试的实验中,试剂的稳定性对最终测试结果的准确性影响很大。因此,我们首先考察了FXa在测试条件下的稳定性。将FXa从4 ℃冰箱中取出后,室温下放置20 min,然后以140 Pa的压力依次导入FXa 3 s和CPS 15 s,自由扩散混合,静置4 min后电泳分离。实验发现,FXa在室温下放置200 min,活性基本保持不变,200 min之后,FXa活性衰减较为明显。但是在室温下,ATⅢ的活性会发生明显的衰减,因此在测试依诺肝素钠抗凝血活性时每分析8个样品更换一次FXa,但是ATⅢ溶液需要每次更换。两种生化试剂在每次从冰箱取出时,均在室温下放置20 min以恢复酶的活性。

样品和试剂在毛细管柱端的混合程度直接影响酶与底物的混合效果和反应,从而对测定结果产生影响。毛细管中一般不存在湍流,因此混合的过程主要通过电泳淌度差和分子扩散两种方式[11,12]。当以较低压力进样时,反应物区带界面能够保持较平整,反应物间的混合是通过分子的纵向扩散实现的。扩散是所有分子的基本性质,因此可适用于具有相同电泳淌度的反应物的混合。纵向扩散混合不会造成反应物的区带发生大的移动,因此混合后的反应物仍然在毛细管柱头保持较小的区带,从而利于高的分离柱效。但是使用这种混合方式不适于多种反应物参与的反应。横向扩散方式发生在混合界面间有横向接触面的反应物区带间[12]。横向界面只有在短时间内施加高压力进样时,由于产生了抛物线形的流速轮廓,使进样后的各个反应物在横向发生接触。然而,为了保证样品区带处于层流状态,所使用的压力也不能太高。图1所示即为利用层流横向扩散的方法实现反应物的混合。在这种方法中不同反应物的溶液依次以较高压力、较短时间进样,使所有反应物之间均有较大的横向接触面积,从而通过扩散达到混合的目的。

依诺肝素钠与ATⅢ的进样体积均相对较小,这两种试剂进样后静置1 min,即采用自由扩散混合并反应;为使依诺肝素-ATⅢ复合物与FXa混合均匀,使用层流横向扩散混合方式, FXa的等电点(pI 5.68)比CPS(pI 6.74)小,因此在反应条件下(pH 7.4), FXa带更多负电荷,为了使游离的FXa与CPS混合,实验在这一步采用电压混合。固定混合电压为3 kV,实验同时考察了混合时间对混合情况的影响。游离的FXa与CPS混合越充分,产生的对硝基苯胺也就越多,根据图2可以看出,当混合时间为0.3 min时,产生的对硝基苯胺最多,因此最终确定电压混合条件为3 kV、0.3 min。

图 2 FXa与CPS混合时间对p-NA反应产率的影响Fig. 2 Effect of the mixing time of anti-factor Xa (FXa) and chromogenic peptide substrate (CPS) on the reaction yields of p-nitroaniline (p-NA)

2.3 方法验证

在优化的电泳条件下,考察了方法的重复性。对硝基苯胺的迁移时间以及经内标校准的峰面积在日内和日间的重复性列于表1。可以看出,经过内标校准后对硝基苯胺峰面积的重复性得到明显改善。随后我们对线性范围进行了考察,如图3所示,在0.025～1.0 mmol/L的对硝基苯胺浓度范围内,线性关系良好。测得方法的检出限(LOD)(3倍信噪比)为0.025 mmol/L,定量限(LOQ)(10倍信噪比)为0.075 mmol/L。如图4所示,在MEKC的分离条件下,CPS、FXa、ATⅢ和依诺肝素钠均不会在4 min内出峰,因此不干扰对硝基苯胺的测定。

表 1 对硝基苯胺迁移时间、峰面积以及峰面积比的日内和日间精密度

图 3 对硝基苯胺的标准曲线(n=3)Fig. 3 Standard curve of p-NA (n=3) Concentrations of p-NA: 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mmol/L; concentration of nitrofurantoin (NF): 0.1 mmol/L; Injection: 140 Pa×10 s. y: peak area ratios of p-NA to NF; x: concentration, mmol/L; R2: correlation coefficient.

图 4 依诺肝素钠标准溶液抗FXa活性测试电泳图Fig. 4 Electropherograms for the determination of anti-FXa activity of enoxaparin sodium (E) Contents of E: S1, 0.087; S2, 0.111; S3, 0.143; S4, 0.183 IU/mL.

2.4 LMWHs抗FXa活性的测试

由于FXa溶液是过量的,依诺肝素介导的ATⅢ对凝血因子活性的抑制作用可以通过测定产生的对硝基苯胺含量获得,这样也就获得了依诺肝素的抗凝血活性。对硝基苯胺是中性分子,实验采用MEKC分离模式。为了保证定量的准确性及良好的方法重复性,采用NF作为内标。在常用的生色肽底物分光光度法中,为了避免发色肽底物和样品基质对硝基苯胺检测的影响，通常选择检测波长405 nm。由于这个波长不是对硝基苯胺的最大吸收波长，因此分光光度法的检测灵敏度较低。我们的方法由于能够将对硝基苯胺与酶反应液中其他成分分开，可以在其最大吸收波长380 nm处检测，以获得最佳的检测灵敏度。

图 5 依诺肝素钠峰面积比-浓度对数值线性校准曲线Fig. 5 Calibration curve of E constructed by peak area ratio vs log concentration value

以依诺肝素钠标准品或供试品溶液含量的对数值为横坐标,对硝基苯胺与NF的峰面积比为纵坐标分别作线性回归曲线,并按照生物鉴定统计法测量反应平行线测定法(4×4法)计算效价和实验误差。使用本文方法测试了两批分别来源于赛诺菲和杭州九源公司的依诺肝素钠药物。将所得数据以标准品(或供试品)溶液浓度的对数值为横坐标,以相应的校正峰面积为纵坐标分别做线性回归,结果见图5。所得到的数据经生物鉴定统计法(4×4法)进行统计分析,计算得到两个批次样品的效价如表2所示,平均可信限率(FL)小于5%,均通过可靠性检测。试品间、剂间回归显著,偏离平行、二次曲线、反向二次曲、区组间不显著(见附表1和附表2,详见http://www.chrom-China.com)。基于MEKC法测得的两批依诺肝素的效价与它们的标示效价一致(标示效价为厂家标注)。

表 2 两个批次样品的效价结果Table 2 Potency results of two batches of samplesSampleAssumed potency/(IU/mL)Determined potency/(IU/mL)SM/%FL/%E-110000 120280.904.9E-212000132820.734.0 SM: standard error; FL: fiducial limit.