毛细管电泳法基于Fe(Ⅱ)与Fe(Ⅲ)的比值识别签字笔字迹的相对书写时间

蔡 瑜, 曹成喜, 卓先义, 李红根, 樊柳荫

(1. 上海交通大学学生创新中心, 上海 200240; 2. 上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240; 3. 上海交通大学电子信息与电气工程学院, 上海 200240; 4. 司法部司法鉴定科学技术研究所, 上海 200063; 5. 上海交通大学物理与天文学院, 上海 200240)

文件形成时间的鉴定是法庭科学领域的热点和难点问题[1]。在许多刑事案件或者民事纠纷中都会涉及文件形成时间的鉴定,比如在违法犯罪活动中,有的伪造早期的文件,以牟取他人的财物或其他权益;有的利用早期的或已经失效的文件添加、改写成有效的日期或内容,以掩盖其违法犯罪事实。在财产纠纷、合同纠纷、债务纠纷和诈骗、贪污、渎职、保险理赔等案件中,为判断文件真伪,对可疑文件上字迹形成时间的研究和建立可靠的鉴定方法是十分必要的。

书写时间的鉴定分为绝对书写时间鉴定和相对书写时间鉴定[2]。前者是通过检验确定书写文件的真实书写时间,后者判断同一文件上两种或两种以上笔迹的时间是否同时形成。由于影响书写字迹的因素很多,判断书写绝对时间难度非常大,因此,相对书写时间的鉴定比较常用。文件相对书写时间的鉴定技术主要有扩散法[3,4]、色谱法[5-9]、光谱法[10-15]、毛细管电泳(CE)法[16,17]等,由于在实际案件中,可疑文件的形成条件和环境状况比较复杂,大多数检验方法不可避免地有各种局限性,例如,检材的取样量、文件的存放环境等。如果能寻找一个不受取样量等条件影响且能有效反映文件材料随时间变化的指标,并从中找出其变化的规律就非常有意义。

早在1940年,Rhodes等[18]发现Fe(Ⅱ)书写在纸张上容易被氧化成Fe(Ⅲ),因此,笔迹中Fe(Ⅱ)的氧化可能为鉴定文件中字迹的相对时间提供一种可能,但由于当时没有合适的分离方法和样品提取方法,无法准确测定笔迹墨水中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的原始含量,也无法准确鉴定Fe(Ⅱ)的氧化程度,即笔迹的相对时间。更重要的是,Rhodes等没有研究墨水瓶中的Fe(Ⅱ)是否容易被氧化,这对于字迹相对时间的鉴定至关重要。

本文建立了一种基于CE法鉴定字迹相对时间的新方法,通过比较从可疑笔迹中提取的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面积比与从整个文档中提取出的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面积比,就可以判断整篇文件是否同时书写。该方法具有快速、样品需要量少等特点,对于鉴别可疑文件中伪造插入的字迹,鉴别真伪笔迹的相对年代具有重要的指导意义。

1 实验原理

鞣酸铁墨水中含有硫酸亚铁、鞣酸、没食子酸,根据它们之间的显色反应,当墨水书写在纸张上暴露在空气中时,Fe(Ⅱ)及其Fe(Ⅱ)络合物氧化成Fe(Ⅲ)。随着时间的推移,Fe(Ⅱ)的量不断减少,Fe(Ⅲ)的量不断增加。因此,墨水中Fe(Ⅱ)的氧化程度可以成为鉴定墨水字迹相对时间的依据。如果可以准确地测定其浓度,那么就可以确定墨水字迹的相对时间。

实验中选择邻菲罗啉(1,10-phen)和反式-1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)两种不同特异性结合的络合剂,1,10-phen特异性络合Fe(Ⅱ),形成[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+; CDTA特异性络合铁离子,形成[Fe (Ⅲ)-CDTA]-。然后用毛细管区带电泳分离检测并通过两种络合物峰面积的比值(R)作为评判Fe(Ⅱ)氧化程度的评价标准,即字迹相对时间的评判标准,评判公式如下:

(1)

式中,A[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+为[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰面积,A[Fe(Ⅲ)-(CDTA)]-为[Fe (Ⅲ)-CDTA]-的峰面积,R为两者比值。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

P/ACETMMDQ型毛细管电泳系统(Beckman Coulter Co.,美国),该系统配有32 Karat软件分析系统、紫外检测仪、液态恒温装置以及自动进样器,可以提供高至30 kV的电压。CE检测波长设置为254 nm。所有的实验温度均控制在25 ℃。未涂层熔融石英毛细管柱,内径75 μm(外径375 μm),总长40.2 cm,有效长度30 cm(河北永年光导纤维厂),超纯水装置(Millipore,美国), 320 pH酸度计(Mettler Toledo,瑞士),高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂), DHG-9070A电热常温干燥箱(易盛科学技术有限公司,上海), HS-120D超声波清洗仪(Scientz生物科技有限公司,宁波)。

硫酸亚铁铵((NH4)2SO4·FeSO4·6H2O,纯度99%),氯化铁(FeCl3·6H2O,纯度99%),苯甲酸(C7H8O2,纯度99.5%),四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O,纯度99.5%),硼酸(H3BO3,纯度≥99.5%),抗坏血酸(C6H8O6,纯度99%)试剂购自上海化学试剂公司,CDTA(C14H22N2O8,纯度99%),1,10-phen(C12H8N2·H2O,纯度99%)试剂购于国药集团化学试剂有限公司,蓝黑墨水购于上海墨水厂。

2.2 溶液配制

标准溶液的配制方法如下:分别配制20 mmol/L的CDTA和5 mmol/L的1,10-phen标准溶液并室温保存。每天使用前新鲜配制10 mmol/L的硫酸亚铁铵溶液,每周配制10 mmol/L的氯化铁溶液。配制的溶液于4 ℃低温保存。

本实验选用Na2B4O7-H3BO3作为背景缓冲液,缓冲液的配制方法如下:首先分别配制100 mmol/L的Na2B4O7溶液和100 mmol/L的H3BO3溶液,然后用100 mmol/L H3BO3溶液将100 mmol/L的Na2B4O7溶液pH调至9.2,并在缓冲液中加入少量的CDTA和1,10-phen络合剂。

2.3 样品前处理条件

剪取1 cm长的墨水迹线,剪碎后放入2 mL的EP管中,然后加入0.5 mL 5 mmol/L的1,10-phen萃取1 min,然后再加入0.5 mL 20 mmol/L的CDTA并用涡旋混匀仪振动10 min,最后,以10 000 r/min转速离心15 min,取上清液用于CE分离检测。

2.4 CE程序及分离条件

电泳开始前,新的毛细管用137.9 kPa压力,按照1.0 mol/L氢氧化钠冲洗5 min,超纯水5 min, 1.0 mol/L盐酸5 min,超纯水5 min,电泳缓冲液5 min的顺序进行处理和平衡,每次进样前用电泳缓冲液冲洗2 min。

CE条件为:熔融石英毛细管(40.2 cm×75 μm i.d.,有效长度30 cm),100 mmol/L硼酸-硼砂缓冲溶液(pH 9.2),分离电压20 kV,压力上样(1.379 kPa,上样时间5 s),检测波长254 nm,分离温度25 ℃,苯甲酸作为内标。同时,为了确保[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+和[Fe(Ⅲ)-CDTA]-在分离过程中的稳定性,在分离缓冲溶液中加入了一定量1,10-phen和CDTA(浓度为0.1 mmol/L)避免络合物解离。

3 结果与讨论

3.1 Fe(Ⅱ)在墨水瓶中氧化速率的研究

要以Fe(Ⅱ)与Fe(Ⅲ)的峰面积比作为鉴定墨水字迹相对时间的指标,首先必须确认Fe(Ⅱ)在钢笔墨盒或墨水瓶中的氧化与在文件字迹中发生的氧化相比可以忽略不计。如果钢笔墨盒或墨水瓶中的Fe(Ⅱ)有明显的氧化,那么检测字迹中Fe(Ⅱ)的氧化对确定文件中字迹的相对时间就没有意义。

鞣酸铁墨水储存在密闭的墨水瓶中,与外界空气隔绝,局部氧分压对Fe(Ⅱ)的氧化影响非常小,且商用墨水的pH值约为2.0,在pH小于3时,Fe(Ⅱ)的氧化速率非常低[19],此外,鞣酸铁墨水中含有大量的鞣酸、没食子酸,这些物质可以与Fe(Ⅱ)形成络合物有效延缓Fe(Ⅱ)的氧化,从理论上讲,Fe(Ⅱ)在墨水瓶中的氧化可以忽略,为了证实此假设,我们对钢笔墨盒和墨水瓶中可能存在的Fe(Ⅱ)的氧化进行了如下实验:首先,每隔几天,从墨水瓶中取出50 μL墨水,经络合剂处理后经CE检测,持续3个月,Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面积比R如图1所示,在大约两个月的时间里,R值从0.3略微下降到0.27,从两个月到3个月甚至更多的时间里,R值几乎保持不变。这意味着Fe(Ⅱ)在墨水瓶中的氧化速率确实较慢,尤其是在使用新墨水两个月后。

图 1 Fe(Ⅱ)在墨水瓶中的氧化Fig. 1 Oxidation of ferrous ions in the gall ink bottle

然而,当墨水暴露在纸张上时,墨水中的硫酸会逐渐被纸张的纤维素所消耗,从而导致Fe(Ⅱ)在纸张中被逐渐氧化,因此,可以通过检测Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面积比R来估计墨水字迹的相对时间。

3.2 CE分离检测Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)

3.2.1Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)与络合剂的特异性络合

Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)无紫外吸收,因此无法直接用紫外进行检测。需要在铁离子溶液中加入络合剂生成具有紫外吸收的络合物。据文献报道,1,10-phen可以特异性地结合Fe(Ⅱ)(Fe(Ⅱ)与1,10-phen的稳定常数为21.3,与CDTA的稳定常数为18.2), CDTA可以特异性地结合Fe(Ⅲ)(Fe(Ⅲ)与CDTA的稳定常数为29.3,与1,10-phen的稳定常数为14.1),本研究采取1,10-phen和CDTA为络合剂与两种金属离子进行络合后进行CE分离检测。

运用CE分离金属离子络合物,络合剂的选择无疑是实验设计中非常重要的部分,络合剂必须要与待测金属离子具有绝对的特异性和高度的结合稳定性,避免在毛细管分离过程中解离。因此,需要对两种络合剂与Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的特异性结合进行研究。首先,将1,10-phen和CDTA的混合溶液加入Fe(Ⅱ)标准溶液中,实验过程中为了避免Fe(Ⅱ)被氧化,Fe(Ⅱ)溶液中加入抗坏血酸抑制氧化,加入苯甲酸作为内标,然后进行CE分离检测,结果见图2a,从图中可以看出,只出现Fe(Ⅱ)与1,10-phen络合物的峰,而不出现Fe(Ⅱ)与CDTA的络合峰,说明在两种络合剂同时出现时,Fe(Ⅱ)首先与1,10-phen特异性络合。然后将1,10-phen和CDTA的混合溶液加入Fe(Ⅲ)标准溶液中进行CE分离,结果如图2b所示,只出现Fe(Ⅲ)和CDTA络合物的峰,而不出现Fe(Ⅱ)与1,10-phen的络合物峰,说明在两种络合剂同时存在时,Fe(Ⅲ)与CDTA特异性络合。

图 2 两种络合剂与Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)的特异性结合Fig. 2 Specific binding between two complexing agents and Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ) ions a. 1,10-phen and Fe(Ⅱ): 40 μL of 10 mmol/L standard Fe(Ⅱ) solution with a small amount of ascorbic acid (antioxidant) with the simultaneous addition of 1.0 mL of 5.0 mmol/L 1,10-phen and 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA; b. CDTA and Fe(Ⅲ): 50 μL of 10 mmol/L standard Fe(Ⅲ) solution with the simultaneous addition of 1.0 mL of 5.0 mmol/L 1,10-phen and 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA. Conditions: 40.2 cm (effective length 30 cm)×75 μm i.d. (375 μm o.d.) capillary; 100 mmol/L pH 9.2 sodium borate acid buffer; voltage, 20 kV; injection, 1.379 kPa 5 s; detection wavelength, 254 nm; temperature, 25 ℃. Peak identifications: 1. [Fe(phen)3]2+; 2. free 1,10-phen; 3. [Fe(Ⅲ)-CDTA]-; 4. benzoic acid; 5. ascorbic acid.

图 3 1,10-phen和CDTA的添加顺序对络合效果的影响Fig. 3 Influence of addition order of 1,10-phen and CDTA on the complexation of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) a. Addition of 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA to the mixture of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) (solution A); b. subsequent addition of 1.0 mL of 5.0 mmol/L 1,10-phen to solution A; c. addition of 1,10-phen, followed by CDTA. Conditions: mixed standard solution: 40 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅱ) and 50 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅲ); other conditions are the same as those in Fig. 2. Peak identifications: 1. [Fe(phen)3]2+; 2. free 1,10-phen; 3. [Fe(Ⅲ)-CDTA]-; 4. benzoic acid.

3.2.2络合剂添加顺序对络合效果的影响

络合剂的加入会影响Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)之间的平衡,因此络合剂的添加顺序有可能对络合选择性有一定影响,为此,我们对Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)混合标准溶液中络合剂的添加顺序进行了研究。将CDTA加入铁离子和Fe(Ⅱ)的混合溶液,然后进行CE分离,电泳图谱如图3a所示,结果只出现[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰,之后在此溶液中加入1,10-phen后再进行电泳分离,结果如图3b所示,出现[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰和1,10-phen的峰,但并未出现[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰,说明溶液中Fe(Ⅱ)都被氧化成Fe(Ⅲ)。如果在Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)标准混合液中先加入1,10-phen,然后再加入CDTA进行CE分离检测,结果如图3c,出现了[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+, 1,10-phen和[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰及内标峰。

将1,10-phen加入Fe(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)的标准混合溶液,然后进行CE分离检测,结果如图4a,只出现Fe(Ⅱ)和1,10-phen的络合物[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰,然后再在图4a的样品溶液中加入CDTA,则会出现Fe(Ⅱ)和1,10-phen的络合物[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰以及Fe(Ⅲ)与CDTA的络合物[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰。图4说明在同时存在两种价态铁离子时,1,10-phen首先络合Fe(Ⅱ)。

图 4 1,10-phen和CDTA的添加顺序对Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)络合效果的影响Fig. 4 Influence of addition order of 1,10-phen and CDTAon the complexation of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) a. Addition of 0.5 mL of 5 mmol/L 1,10-phen to the mixture standard solution of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) (20 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅱ) and 40 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅲ), solution A); b. subsequent addition of 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA to solution A. The separation conditions are the same as those in Fig. 2. Peak identifications: 1. [Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+; 2. free 1,10-phen; 3. [Fe(Ⅲ)-CDTA]-; 4. benzoic acid.

图3和图4结果进一步证实了1,10-phen和CDTA对Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的特异性络合。此外,实验结果表明,两种络合剂的添加顺序对两种铁离子的检测有较大的影响。可能是因为络合剂的加入会影响Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)之间的动态平衡,先加入CDTA可能会导致Fe(Ⅱ)的反应向氧化方向进行。

3.2.3两种络合剂添加时间间隔对络合效果的影响

既然络合剂添加顺序对两种铁离子的平衡会有影响,那么添加的时间间隔是否会对反应平衡有影响?为此,本研究选取了10、30、60、180和300 s 5个不同的时间区间,考察了两种络合剂加入的时间间隔对两种铁离子测定的影响。从表1可以看出,随着时间间隔的逐渐延长,A1/A2(A1、A2分别为[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+和[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰面积)的值逐渐缓慢增加。结果表明,先用1,10-phen处理后再用CDTA处理的样品确实使平衡向Fe(Ⅲ)还原的方向移动,但移动速度要慢得多。由表1进一步可以看出,当时间间隔设置在60 s以内时,时间间隔对A1/A2比值的影响很小。然而,如果间隔设置为180 s以上,影响就会变得非常强。因此,两种络合剂添加的时间间隔控制在60 s。

表 1 络合剂添加时间间隔对络合平衡的影响(n=3)

3.3 实际样品分析

为了评价所建立方法的适用性,本研究对两种鞣酸铁墨水字迹中的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)进行了检测。图5为CE分离谱图,可以看出:用该方法可以检测到两种铁离子的络合物[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+和[Fe(Ⅲ)- (CDTA)]-的峰,并且随着书写时间的延长,A1/A2的比值变小,证实了Fe(Ⅱ)逐渐被氧化成Fe(Ⅲ),墨水1和墨水2的A1/A2分别从1.79降到0.45和从2.67降到0.3。两种墨水从书写到书写后75天A1/A2的变化证实所建立的方法可以用于鞣酸铁墨水字迹相对时间的鉴定,墨水1和墨水2中两种铁离子峰面积比值不同的原因可能是两种墨水的成分不同。图5的结果简单地证明了本研究所建方法可以用于鞣酸铁墨水字迹相对时间的鉴定。

图 5 两种墨水字迹的电泳谱图Fig. 5 Electropherograms of two gall ink handwriting samples a. sample of gall ink handwriting written on 26th Sept., 2018; b: sample of gall ink handwriting written on 10th Dec., 2018. The conditions are the same as those in Fig. 2. Peak identifications: 1. [Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+; 2. [Fe(Ⅲ)-(CDTA)]-.

4 结论

本文建立了一种简便、快速测定鞣酸铁墨水字迹中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的CE技术。通过比较从可疑笔迹中提取的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)峰面积的比值与从整个文档中提取出的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)峰面积的比值,就可以判断整篇文字是否同时书写,对于鉴别可疑文件中伪造插入的字迹,鉴别真伪笔迹的相对年代具有重要的指导意义。如果能进一步研究字迹相对时间的曲线及其影响因素,例如环境温度、湿度、光线等,便可以测定不同文件字迹的相对时间,相关研究正在进行中。