毛细管电泳药物筛选方法与技术

钱 鑫, 田 晏, 罗欣欣, 潘静苗, 邓苏雅, 黄一可, 付琦峰, 夏之宁*

(1. 重庆大学药学院, 重庆 401331; 2. 重庆医科大学药学院, 重庆 400016; 3. 西南医科大学药学院, 四川 泸州 646000)

药物筛选是使用适当的方法和技术,从众多化合物中筛选出具有药理活性的化合物的新药研发过程。药物筛选的数量越大,范围越广,发现新药的概率也就越大,因此研究人员不断地对药物筛选方法和技术提出新要求。

药物筛选方法之一是以药代动力学为基础[1],通过对候选化合物在人体吸收、分布、代谢和排泄的性质以及化学毒性等因素进行综合评估,筛选出更有开发价值的化合物。另一种是以药理活性为基础的筛选[2],其基本方法是评价药物与靶点的结合能力以及对靶点功能的影响,从而筛选出具有一定药理活性的化合物。药物筛选的方法主要是以相互作用研究为基础，建立以酶、受体、核酸等化合物为靶点的药物筛选模型，从而进行化合物的活性评价。

药物筛选技术较多,目前依靠仪器手段的药物筛选主要有高通量筛选、高内涵筛选以及微流控芯片筛选等。毛细管电泳(CE)依靠的研究介质体系是水溶液,可以模拟生命介质环境而进行药物筛选,且筛选过程不引入其他干扰作用,即能比较准确地反映药物与靶点的相互作用,又具有效率高、通量可扩展以及试样量小等优点,已成为潜力较大的药物筛选方法。

1 CE药物筛选的基本原理

1.1 以药代动力学相关性质为基础的筛选

对于结构非特异性药物,弱酸候选药物的酸平衡性质(pKa值)以及候选药物的油水分配系数(Po/w值)直接影响其药代动力学参数,从而影响药效。传统测定pKa值或Po/w值的方法建立在对候选化合物两相平衡浓度的测定之上。CE相对于传统的测定方法,具有速度快、操作简便、试样消耗量小等特点,且对化合物的纯度要求不高,有多种模式可供选择,因而在pKa值和Po/w值的测定中展现出独特的优势[3]。

当候选化合物具有弱酸性或弱碱性时,在生物体内将部分解离形成离子型和分子型两种状态。分子型穿过生物膜后解离成离子型发挥药理作用,因此药物筛选的目标是筛选出具有适当解离度的化合物。使用CE测定pKa值基于的是有机酸碱的电离平衡理论,其利用了有效电泳淌度与氢离子浓度[H+]之间的非线性关系[4]。

对于一元弱酸(HA)化合物,溶质的有效淌度(μeff，cm2/(V·s))和缓冲溶液[H+]之间的非线性关系为:

(1)

式中,μA-为药物离子淌度(cm2/(V·s)),可由候选药物迁移时间(s)和毛细管的长度(cm)等参数获得;Ka为弱酸解离常数。CE可测得一系列不同酸度下药物的μeff值,然后通过线性回归求得Ka值。

药物Po/w值的测定主要采用胶束或微乳电动色谱法(MEEKC)。该法不受药物溶解度的局限,并适应任何pH条件,可以通过对一系列已知Po/w的标准品进行MEEKC分析来测定Po/w[5],依据的理论公式为:

(2)

1.2 以相互作用为基础的CE筛选

运用CE方法分析药物与靶点的相互作用获得结合常数Kb值的药物筛选方法分为两类:一类是根据药物的电泳淌度在受体存在后发生变化来测定Kb值,方法有亲和毛细管电泳法(ACE)[7]和空位亲和毛细管电泳法(VACE)[8];另一类是根据配受体结合物离解后的平衡浓度求得Kb,方法主要包括配体分离法(LS)[9]、空位峰法(VP)[8]、Hummel-Dreyer法(HD)[10]和前沿分析法(FA)[11]。

1.2.1亲和毛细管电泳

ACE是研究分子间相互作用最常用的方法,该法基于配体-受体相互作用原理进行药物筛选。1992年,Chu等[12]使用CE对万古霉素和多种肽进行相互作用研究,从中筛选出了与万古霉素相互作用最强的肽。随后,该团队[7]将这种对物质间相互作用进行研究的方法正式命名为亲和毛细管电泳法,同时建立了基于Scatchard方程的分析方法。在此基础上,Zhang等[13]对该分析方法进行了改进,利用淌度比对Kb值进行求解,这一改进消除了毛细管长度、黏度与运行电压对测定结果的影响,从而提高了ACE在药物筛选中的重现性。

ACE依据受体或配体在发生亲和作用后有效电泳淌度的变化进行Kb值的求解。可供选择的受体-配体体系有:蛋白质(P)与药物(D)、DNA与药物、抗体与抗原、酶与底物等。

(3)

经过推导后,可得到Scatchard方程:

(4)

对其进行变形可得到:

(5)

(6)

公式(4)、(5)、(6)分别为双倒数法、y-倒数法和x-倒数法。μD代表游离药物淌度(cm2/(V·s)),μPD代表复合物淌度(cm2/(V·s)),μP-PD代表游离和结合两种形态蛋白质共同贡献的淌度(cm2/(V·s))。采用以上3种方法作图均可求得结合常数Kb值:双倒数法以1/(μP-PD-μD)对1/[P]作图,所得直线的截距与斜率之比为Kb值;y-倒数法以[P]/(μP-PD-μD)对[P]作图,所得直线的斜率与截距之比为Kb值;x-倒数法以(μP-PD-μD)/[P]对μPD-μD作图,所得直线的斜率即为Kb值。利用此方法,Li等[14]对布洛芬和阿司匹林与血清白蛋白之间相互作用进行了研究,比较了它们的Kb值;Katriina等[15]也研究了载脂蛋白B与6-硫酸软骨素的相互作用。

1.2.2动力学毛细管电泳(KCE)

在药物筛选的过程中,结合常数Kb、配受体的正向结合速率常数Kon和反向解离速率常数Koff是3个有意义的参数。其中,Kon和Koff是表征配体和受体间结合速率、指导药物在体内药代动力学应用,以及药物起效快慢、对机体作用程度的参数。ACE只能测定结合常数Kb值。2005年,Krylov团队[16]提出了动力学毛细管电泳,除了可以测定Kb,还能测得动力学常数Kon和Koff。

药物靶分子(T)与配体分子(L,生物大分子)首先进行亲和相互作用,随后通过电泳将具有不同迁移速率的药物靶分子、配体分子和结合物(C)进行分离,通过建立数学方程式描述KCE的传质过程,并求解出动力学参数Kon、Koff和Kb等。按照不同的初始条件和边界条件,将KCE分为7种模式[17],如表1所示,即平衡混合物的非平衡CE(NECEEM)、平衡混合物的平衡CE(ECEEM)、扫集CE(Sweep CE)、区带顺进CE(ppKCE)、连续平衡混合物之非平衡CE(cNECEEM)、短扫集CE(sSweep CE)和平衡混合物之短扫集CE(sSweep CEEM)。表中均假设T的迁移速率大于L的迁移速率。

表 1 7种动力学毛细管电泳示意图

1.2.2.1NECEEM与ECEEM

NECEEM最早用于蛋白质-DNA相互作用的研究[18],其过程包括将靶标、配体事先混合孵育,使其达到平衡状态后进样,根据混合物中T、L以及T-L复合物淌度的不同进行电泳分离,背景缓冲液中不存在T,造成T-L复合物在电泳过程中不断解离,该分离在非平衡状态下进行。该方法可通过一次电泳测定Kb和Koff,进一步求得Kon。

NECEEM可以作为一种单通量的药物筛选方法,以法尼基转移酶(PFTase)为模型靶标蛋白,通过NECEEM方法测得筛选前DNA文库的解离常数Kd值,然后将平衡混合物中PFTase的浓度改为nmol/L级别,使用该法在一轮筛选后得到了Kd值为nmol/L级别的DNA适配体,筛选前后DNA文库的整体亲和力增加了200倍,该报道[19]首次将NECEEM方法引入核酸适配体的筛选中,高效、准确的特点令其成为筛选核酸适配体的主要方法。

与NECEEM不同,ECEEM的分离是在运行缓冲液中含有相同浓度T的条件下进行的,即T-L复合物在分离过程中始终保持平衡状态。ECEEM的独特之处在于,具有不同Kd值的配体以不同且可预测的迁移率迁移。因此,选择具有不同迁移率的组分会得到具有不同且可预测的Kd值的配体[20],能在复杂的候选药物共存体系中发挥筛选评价作用。

除了单独使用,也可以将NECEEM和ECEEM结合,用于DNA编码化合物的筛选[21]。以碳酸酐酶Ⅱ(CA Ⅱ)为模型靶蛋白,模型库中包含与CA Ⅱ亲和力强(Kd=490 nmol/L)的DNA编码苯甲酰胺(DNA-BSB)和亲和力弱(Kd≫100 μmol/L)的DNA编码色胺(DNA-tryptamine),其比例为1∶105。在两轮筛选后,成功将混合库中DNA-BSB与DNA-tryptamine的比例升至11∶1,且DNA-tryptamine的量低于聚合酶链式反应(PCR)的检出限,与预测情况相符。该报道[21]证明了使用NECEEM和ECEEM结合的方法不仅可以对筛选的配体进行定性,还可对其定量,有望用于筛选海量的DNA编码化合物库。

1.2.2.2Sweep CE

与NECEEM不同,Sweep CE不用预先孵育平衡混合物,而是使毛细管内都具有L,并将T装于入口瓶中。由于L的电泳淌度小于T,电泳开始后,T不断穿过L并与之形成C。Sweep CE主要研究的是L、T的结合过程,因此可直接测定Kon。Krylov课题组[22]利用该法研究了单链DNA结合蛋白和15聚体DNA寡核苷酸之间的相互作用,并测得Kon。

1.2.2.2ppKCE

ppKCE与NECEEM类似,但没有预先注入平衡混合物,而是将T和L以区带的形式注入充满运行缓冲液的毛细管中。电泳开始后,T穿过L形成C,并伴随有C的解离。因此ppKCE可通过一次过程直接测定Kon和Koff[16,23]。ppKCE主要用于考察蛋白质和DNA间的相互作用,本课题组[24,25]在前人的基础上将ppKCE扩展到蛋白质与小分子间相互作用的研究上,研究了其与西酞普兰、依匹斯汀、加替沙星及罗沙替丁间的相互作用,并测定了Kon、Koff及Kb值。其他诸如cNECEEM、sSweep CE和sSweep CEEM等方法也都各有特色,并成为潜在的CE药物筛选方法。

1.2.3配体分离法

Heegaard等[9]曾使用另一种方法对结合常数进行求解,并将其称为配体分离法。LS与ACE和KCE最大的区别是其依据浓度变化进行相互作用分析。该方法的运行缓冲液中不含有蛋白质或者药物,而是将相同浓度的蛋白质和药物预先混合作为样品,待结合达到平衡后进入毛细管。游离药物和结合物的浓度随蛋白质浓度的变化而变化,根据这些变化便可计算得到蛋白质和药物之间的结合常数Kb值。对蛋白质纯度的要求较低是LS的主要优点。利用此方法,Wang等[26]测定了牛血清白蛋白(BSA)与其单克隆抗体的Kb值;张勃等[27]也测定了抗真菌药物棘球白素B的母核与其多克隆抗体之间的结合常数,并建立了以结构为基础的药物筛选模型。该法存在一定的局限性,因为要求配体与受体的结合能力足够强,生成的结合物足够稳定,以保证使用该方法时不会因为结合药物的解离而对游离药物含量的测定产生影响。

表 2 毛细管电泳相互作用分析方法

1.2.4其他方法

VACE与ACE原理基本相同,区别在于VACE依据两个负峰迁移时间的变化计算结合常数[28]。Busch等[29]曾将VACE用于万古霉素与N-Ac-d-丙氨酰-d-丙氨酸组成的体系进行相互作用的研究,其结果与ACE所得结果具有良好的一致性。VP与VACE的操作类似,不同的是VP法要求溶质和配体有相近的淌度[8]。Busch等[8]利用此方法研究了华法林与BSA的相互作用,并测定了Kb值。HD主要是通过测定游离药物负峰的面积得到游离药物的浓度,从而计算得到Kb值[10]。Quaglia等[30]用该法测定了α-酸性糖蛋白(AGP)与头孢曲松之间的Kb值。FA通过向毛细管中注入药物、蛋白质及药物-蛋白质复合物形成的平衡样品混合物,依据迁移率的不同进行分离[11]。Ding等[31]用该法研究了碱性药物与人血清白蛋白(HSA)之间的相互作用,并测得结合常数Kb值与结合位点数n。

这些方法各有特点,应依据研究中的不同情况选择适宜的方法,表2为这些分析方法的汇总。

1.3 CE筛选应用体系

CE药物筛选中，与药物作用的对象有许多,如核酸、蛋白质(包括抗体和酶等)等生物分子和细胞膜、细胞(细菌),其中一些价格昂贵,难以获得。CE的样品用量在nL级别,能在类似于生命介质的环境下运行,已应用于生物分子与配体的相互作用研究和筛选。

1.3.1以蛋白质为作用对象

以蛋白质为受体的CE药物筛选技术包括以下几类体系:

第一类是血浆蛋白。由于药物进入人体发挥药理作用的过程中需要与血浆蛋白结合,因此对蛋白质与药物的结合特性，诸如结合位点数、结合常数等进行研究对新药的筛选具有较大意义。郭宝元等[32]在CE相互作用分析中发现,采用峰漂移法对药物与蛋白质进行相互作用研究比其他方法效果更好。在此基础上,该团队对麻黄碱、咖啡因、扑热息痛与BSA的相互作用进行了研究。Jiao等[33]综述了中药有效成分与血浆蛋白结合的常用分析方法,总结了不同类型中药活性成分与血浆蛋白结合的规律。

第二类是抗原(Ag)。建立在抗体(Ab)和抗原间特异性免疫反应的方法称为免疫分析,将CE应用于免疫分析领域,便形成了一种新型的免疫分析技术,即CE免疫分析法(CE immunoassay, CEIA)。Hurrell等[34]于1986年便将CE用于免疫分析领域研究中。Luo等[35]对CEIA进行综述,并将CEIA分为竞争性与非竞争性两种。竞争免疫分析法通过对受标记的抗原-抗体复合物[Ag*-Ab]和[Ag*]两个峰的信号进行比较,可计算得到[Ag]的含量。而在非竞争免疫分析则通过检测[Ab*-Ag]与过量的[Ab*]的峰信号实现定量分析,抗原、抗体的标记物可为放射性同位素、酶、化学发光剂等。竞争性分析适用于低分子量的抗原或抗体分子;而非竞争性分析适用于分子量较大的蛋白质。利用CEIA法,Liu等[36]对阿霉素及其单克隆抗体进行了研究,建立了依据荧光特性的抗癌药物分析方法。张勃等[27]将CE技术与结构筛选结合起来,建立了以结构为基础的药物筛选模型,用于具有抗原类似结构的化合物的筛选。该药物筛选模型具有高特异性、高筛选效率的优点。

第三类是具有催化功能的酶,当前对酶抑制剂的活性评价与筛选逐渐成为研究热点之一。康经武等[37]综述了CE在天然产物中酶抑制剂筛选的研究进展,并总结了转移酶、水解酶及氧化还原酶的抑制剂在CE筛选中的研究成果。在CE筛选中,酶抑制剂的筛选主要有柱前酶反应模式和在柱酶反应模式这两种不同的分析方法。而根据是否将酶固定在毛细管中,在柱酶反应模式又可分为电泳中介微分析(EMMA)与固定化酶微反应器(IMER)两种模式。

EMMA技术于20世纪90年代初期,由Bao等[38]首次提出:利用游离的酶与底物在电场下具有不同的迁移速度,通过扩散作用,使其混合均匀,并根据电泳淌度的差异进行分离。王海荣等[39]采用该技术对抗癌药物的热门靶点进行了研究,建立了氨肽酶N抑制剂的筛选模型,为抗癌药物的筛选提供了新的方法。

IMER技术通过适宜的方法将酶固定于毛细管内壁,将待筛选的样品与底物混合后进样,测定产物的峰面积并将其与仅底物进样时的产物峰面积进行对照，判断样品对酶的抑制能力,以此达到对酶抑制剂进行筛选的目的。该法将酶固定于毛细管中,因此具有良好的稳定性,此外还有可重复利用以及样品消耗少等优势。Cheng等[40]采用IMER法对胰蛋白酶进行固定化并实现了对15种中药成分进行酶抑制剂的在线筛选,证实了黄芩苷对凝血酶的抑制活性。

1.3.2以细胞(细菌)为作用对象

CE在细胞水平上的药物筛选体系主要包括细胞-配体[41],细菌-配体[42]以及细胞膜-配体[43]。CE以水溶液为介质,接近人体真实环境,并具有微型化和高通量等特点,已成为细胞水平上药物筛选的有力工具。夏之宁等[32]使用ACE方法对细胞和药物进行了研究,对麻黄碱、咖啡因和肾上腺素与红细胞的相互作用进行了比较。Li等[44]研究了喹诺酮类药物与细菌之间的相互作用,基于细菌与抗菌对映体的立体选择性和亲和性,建立了一种细菌手性选择分离氧氟沙星的新方法,为对映体分析、手性药效学和手性药代动力学研究提供了新途径。Xia等[43]将细胞膜作为假固定相采用CE峰漂移法测定了西酞普兰和兔红细胞膜的Kb值,后又以ppKCE为理论基础测定了多种药物与红细胞膜的相互作用[24]。

1.3.3以核酸为作用对象

绝大部分药物都是以受体分子、酶、离子通道为作用靶标,以核酸(DNA或RNA)为靶标的药物主要包括抗菌药、抗病毒药及抗肿瘤药物。以核酸为靶标的药物筛选技术有滤膜结合试验、凝胶滞后试验、表面等离子共振以及基于荧光的高通量筛选技术等,目前尚无CE应用于以核酸为靶标的药物筛选相关报道,但由于CE可在类似于生命介质的环境下进行并具有微量快速分析的特点,可以预见该类药物的CE筛选将很快出现。

1.4 CE筛选药物的类型

1.4.1核酸适配体

核酸适配体是从大量的核酸分子文库中筛选出的短链寡核苷酸,能与许多目标物特别是蛋白质特异性结合,而且稳定性好,容易制备及修饰,被广泛应用于各个领域。指数富集配体系统进化技术(SELEX技术)是筛选适配体的经典方法,但在配体靶标复合物与游离配体分离技术上遇到了瓶颈。CE筛选过程是在溶液相中完成,无须介质固定,且筛选成本低,速度快。自2004年Bowser等[45]首次将CE和SELEX技术结合,该技术不断发展并在核酸适配体筛选上展现出独特优势,被认为是核酸适配体筛选的最高效方法。

基于CE-SELEX，有3种主要的动力学筛选模式:NECEEM模式、ECEEM模式和non-SELEX模式。Berezovski团队[19]采用NECEEM模式对8种适配体进行了药物筛选。在这些适配体中,获得了对PFTase具有nmol/L级亲和力的最佳适配体,其Kd值为0.5 nmol/L。这些结果证明了NECEEM可以作为开发和利用寡核苷酸适配体的通用工具。随后,该团队进行了h-Ras蛋白的核酸适配体筛选,证明了基于NECEEM的non-SELEX筛选技术无须PCR扩增,且筛选效率高[46]。

屈锋团队[47,48]自2007年开展CE-SELEX以来,已用多种CE-SELEX筛选模式成功筛选出多尺度靶标(如小分子、蛋白质、细胞和微生物)的核酸适配体,并对筛选核酸适配体的CE方法进行了系统综述。杨歌等[49]将80 nt的单链DNA库与盐酸克伦特罗混合孵育,筛选出亲和力较强的3条序列,为小分子靶标的核酸适配体筛选奠定了基础;同样,他们[50]也用CE-SELEX技术筛选出了人免疫球蛋白G(IgG)Fc片段的核酸适配体,该适配体未来可能用于IgG效应功能的调控。

1.4.2天然药物

天然药物可能具有十几种甚至更多成分,往往不易进行分离分析,这给单独活性评价带来困难。而CE具有对多成分复杂体系分离的能力,因此使用CE对天然药物进行研究十分普遍,且分离分析的同时可进行活性筛选。Huang等[51]利用CE分离和鉴定油菜提取物，并评价了其中酚酸和类黄酮物质的抗氧化活性。Tsukagoshi等[52]、Yang等[53]和夏之宁等[54]均使用基于鲁米诺反应的CE-CL联用技术对天然药物中抗氧化活性进行了研究,丰富了天然药物抗氧化剂的CE筛选基础工作。

2 CE药物筛选相关技术

2.1 化合物库筛选技术

DNA编码化合物库(DECL)技术是一种在分子水平进行药物发现的高效方法,具有海量化合物成员数量、超高效筛选速度等特点,被制药界公认为近年来创新药物领域发展最快速且最重要的手段之一[55]。迄今,通过DECL技术已成功筛选出若干临床化合物。例如葛兰素史克公司的针对可溶性环氧化物水解酶的抑制剂GSK2256294[56],以及针对受体相互作用蛋白I的首创新药GSK2982772[57]。Drabovich等[58]充分利用DECL在药物筛选中高通量、高效率的优势,将这种先进的DECL技术与CE技术进行结合。利用CE中DNA-小分子耦合物、靶标蛋白、DNA-小分子耦合物与靶标蛋白复合物这3类物质间的电泳淌度不同来分离,从而达到在同相中进行药物筛选的目的。

2.2 馏分收集技术

虽然试量小是毛细管电泳的优点,但是极微量的样品经分离后的馏分收集是CE的一大问题,因此关于CE的馏分收集鲜有报道。在使用CE进行药物筛选的过程中,需要将毛细管内特定区域的馏分收集起来进行二次鉴定,如未知成分需进行MS检测,未知序列的DNA需经PCR后测序等。

应用CE馏分收集技术,得以将CE和SELEX结合,成为筛选亲和力为nmol/L级别的抗IgE适配体技术[45]。采用传统的SELEX技术,与靶标蛋白结合紧密的DNA很难从色谱柱上洗脱下来,SELEX与CE结合后,DNA复合物与游离DNA淌度有明显差异而得以分离,再应用CE馏分收集技术回收筛选出的DNA。non-SELEX方法[19]以确定收集窗的方式收集馏分,进行多次NECEEM分离,将ssDNA库的亲和力提高了5个数量级,筛选效率大大提升。罗昭锋等[59]将馏分收集毛细管电泳(fraction collection CE, FCE)与SELEX技术结合提出了FCE-SELEX方法,他们将收集窗分成小段,分开收集,根据逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的循环次数确定结合复合物的位置,仅用一轮筛选就获得了亲和力为nmol/L级别的链霉亲和素适配体。该方法一改前面大范围收集的作风,提出了分段收集的新概念,是CE药物筛选馏分收集方法的新举措。

2.3 CE-CL联用技术

将CE与自由基氧化发光反应体系进行结合,便可构建毛细管电泳-化学发光联用装置[60],该装置的原理是自由基可使发光试剂氧化发光,而抗氧化剂对自由基的清除作用可造成化学发光受到抑制,通过对抑制程度进行测定，实现抗氧化活性的评价。在CE-CL基础上进一步发展,构建紫外吸收-化学发光双检测系统,可以实现对多组分复杂样品的筛选。因此可将其应用到中药复杂体系中,对筛选天然产物中的抗氧化剂具有重要的应用价值。

2.4 CE-MS联用技术

毛细管电泳-质谱联用技术不仅具有CE对复杂体系的高效分离能力,同时具有质谱对组分的强大鉴定能力。CE可以将众多化合物成分进行分离,同时根据化合物之间的相互作用能力差异,筛选出候选化合物。MS能将这些候选化合物进行定性,有利于微量，甚至超微量的组分鉴定。因此,这种双重功能使CE-MS技术成为一种有潜力的药物筛选手段。例如,对酶的活性评价及酶抑制剂筛选中,Hoffmann等[61]基于CE-ESI-MS/MS研究了α-胰凝乳蛋白酶(α-CT)与5种酶抑制剂的相互作用,并对其亲和力进行了比较,MS的高灵敏性以及对目标化合物的识别能力弥补了CE无法定性的问题。两者的配合使用使得基于相互作用所筛选的候选药物更加有效和准确。Langmajerova[62]利用毛细管的层流剖面横向扩散原理,使CE-MS联用中的毛细管兼具酶反应器和分离柱两个功能。在一次实验中对细胞色素P450酶(CYP2C9)与底物的反应产物进行了定性和定量分析,这种方法可作为新药开发早期筛选潜在候选药物的有效工具。Li等[63]首次采用ACE分析方法,利用CE-MS技术建立了快速筛选并在线测定结构的方法,成功地在甘草提取物中发现了两种与包膜蛋白gp120的核心靶点R15K有显著相互作用的化学成分,并在细胞水平的生物活性实验中进一步证实了它们抗艾滋病(HIV)的活性。这为在天然产物中发现HIV抑制剂提供有利的筛选手段。

2.5 微流控芯片

微流控芯片(microfluidic chip)是将样品制备、反应、分离及检测集成于一体的分析装置,其与CE的结合使之具备了高通量的优势,这是传统CE不具备的。微流控芯片自开始就在DNA及蛋白质领域显示出极强的功能,目前已被广泛用于其他化合物的研究。Tokuyama等[64]利用微流控芯片，监测肥大细胞的组胺释放过程,并将其应用于抗过敏药物的筛选。Wu等[65]开发了一种新型多层微流控装置,用于表征人肝微粒体中的药物代谢及细胞毒性,展示了微流控芯片在药物开发中进行高通量药物筛选的潜力。

3 结论与展望

回顾历史,人们利用CE技术进行药物筛选的研究已经走过了30年的路程。随着药物筛选的需求不断扩大,基于CE的药物筛选技术具有潜在的优势和广阔的应用前景。但是因为CE试样用量小的特点和馏分收集困难等缺点,使之与HPLC相比一路走来显得进展缓慢,应用范围及效果不尽人意。然而,随着多种联用技术的发展,包括联用进样技术、联用检测技术和馏分收集技术等,CE在药物筛选中崭露出新的头角。更重要的是,CE与其他手段相比具有独特的优势,包括筛选环境更接近于生命介质体系、药物与靶点间的相互作用受外力影响较小、有较多灵活的评价与筛选的方法。这使得CE在药物筛选领域的应用潜力不断增加,目前已出现了许多可以借助CE优势的药物筛选探索,例如适配体筛选、中药等复杂多组分体系筛选和DNA编码化合物库药物筛选等。相信利用CE进行药物筛选的良好前景尽在眼前。