超重现毛细管电泳的理论与例证

陈 义

(淮阴工学院, 江苏 淮阴 223001; 中国科学院化学研究所, 中国科学院活体分析化学重点实验室, 北京 100190;中国科学院大学, 北京 100049; 北京分子科学国家实验室, 北京 100190)

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)有丰富的分离模式[1],可从纯电泳过渡到纯色谱,适用面广,加上其绿色经济、微量高效、简便多用等诸多特点,本当前程无量,可事实却不尽然:CE颇受诟病,多责其不稳或不重现。然重现(reproducibility)与重复(repeatability)并不同义。重复对应于精度,多以日内、日间相对标准偏差考量;重现乃指变参数测量,除质谱(MS)等少数方法外,皆不重现,非CE之弊。但不重现之CE,有损其定性能力,颇有贻害。因作者长期经营CE,不忍其受贬,尝多方挖掘解决之法,亦作经年理论推演,稍有发现,乃作此文。

1 时间测量模式

CE如色谱,皆以时间为变量构建测量模式,源头可能出自牛顿力学第二定律。用其推得电动分离方程为:

(1)

式中m为离子质量,μ为淌度,E为电场强度,Fi为阻力,q为离子所带有效电荷,它们皆与t时间变量关联。时间测量自然天成,但贻害不浅。

考虑溶液阻力源于对抗速度,或有∑Fi=fυ,则式(1)解为:

(2)

时间显于指数,对应于加速。当t>τ后,指数项可略,μ保持不变。在CE介质中,τ仅在皮秒级,所以CE实际是恒速电泳,但须受电泳、电渗和相分配机制共同控制,各有权重加到实测淌度上[1]:

(3)

式中n为溶质分子数,μem为离子有效淌度,μos为电渗率,下标sum表示相加、p指相数。若管中只有两相,则上式变为:

(4)

式中下标L表示缓冲液,P表示固定相。CE中的固定相可能是准固定相,也会电泳或随电渗迁移。k为保留因子,定义为:

(5)

可用离子或中性组分测定。对于中性分子,若固定相不动(tP=∞)并令tos=t0,则k=(tR-t0)/t0,与色谱无异。依公式(3)或(4), CE当作加权淌度谱,但现实CE却换测时间:

(6)

式中LR为迁移长度,从而忽略了淌度、电场随距离、时间的变化,引入许多误差。CE多用弱电解质缓冲溶液作介质,若价数z+=|z-|=z,则由溶液欧姆定律有:

(7)

式中I为电流强度,S为毛细管内横截面积,F=96 487 C·mol,σ为缓冲液电导率。cefb是缓冲液中电解质折合成1-1价后的活度,是解离度α、浓度c(mol/m3)、活度系数γ和价数z的乘积。μ0为绝对淌度,下标b表示缓冲液,正负号指示离子。合并式(6)与(7),整理得:

(8)

式中VR=SLR,叫迁移体积。该式清楚显示,tR与毛细管(S、LR或VR)、电场(E、I、V等)、缓冲液(σ或α、γ、c、z、μ0等)、样品等4类参数有关。样品还受缓冲液影响,它们共同受制于介电常数、黏度、温度等;样品淌度还受电渗和固定相控制。有如此众多且互相制约因素的影响,tR很难精密,遑论重现。比如改变电压或毛细管参数等其他因素,出峰位置即随之改变。不少文献报道过用无缓冲能力的“缓冲液”做CE,其α不定,出峰必无法重现。

国内外为解决上述问题,提出过不少方法,首要者是稳定电渗[2]。电渗远快于离子淌度,并与管壁状态、缓冲液组成、样品性质等都有关系。样品的非特异性吸附会改变管壁状态,影响电渗。缓冲液种类、浓度、pH、黏度、介电常数皆影响管壁基团解离和双电层结构,直接影响电渗。另外,缓冲液浓度等还影响电流和焦耳热,间接影响电渗,再影响tR。为此,要确保有足够的缓冲容量并惰化管壁。除规范清洗毛细管的程序、稳定缓冲液pH、黏度等[3-5]外,还可对毛细管壁做专门处理,如加载键合[6-9]或动态涂层[10-14]、施加横向电磁场[15-18]等。抛光管口、稳定进样也有一定效果。然此类研究至多能提高CE精度,无法改变重现性。管壁涂层因有寿命问题,反而可能降低精度。能在一定程度上改变重现性的方法,是做出峰时间比例谱Rt=tR/tos[9,19]。它以电渗为参考点,能抵消所有影响电渗的因素,但无法作实时测量,需事后分析。一言以蔽之,在时间概念内改造CE,至今不太显效。看来需得跳出时间藩篱,发展非时间测量之法了。

2 非时测量模式

为推导非时间测量方案,需把公式(6)中忽略的因素找回。用式(7)把式(6)变为:

(9)

若认为迁移距离变量l与σS无关,仅电流密度I/S与t关联,则：

(10)

这便是迁移指数即MI法[9],式中i为电流密度。上述假设明显不太合适,更为普适的假设应为:管内灌有均匀的缓冲液做恒温CE。此时只有αγ、σ、μ的变化微小因而可略,故有:

(11)

式中VR为有效迁移体积,积分了管径随距离的变化,可用已知σ和μ体系表征测得。QR是可实时测量的非分析型时间函数,静电学中叫电量,CE文献中误为电通量[20],本文称其为迁移电量或出峰电量。将式(7)代入并整理得:

(12)

其中ρR=QR/VR为出峰电荷密度或电密度,它与MI类似但隐含条件不同;gR=ρR/cefb是等效于1-1价电介质的出峰摩尔电荷密度,简称摩尔电密度。公式(12a)与(12b)等价,适用于所有样品成分,包括离子和分子。若中性分子只随电渗迁移,可得电渗率测量公式:

(13)

显然QR、ρR、gR皆可与μ互换,与样品本质属性关联,可用于构造新的CE测量方式。已知离子有效淌度μem是扩散系数D、离子半径r或质量m的函数,它们也能用CE测量或反过来构造测量模式。由此可以推得至少以下新的CE测量模式:加权淌度谱(weighted mobility spectrometry, WMS)、迁移电量谱(migrated charge spectrometry, MCS)、电密度谱(charge density spectrometry, CDS)、摩尔电密度谱(molar charge density spectrometry, MCDS)、扩散系数谱(diffusion coefficient spectrometry, DCS)[22]、液相质谱(liquid-phase mass spectrometry, LMS)等。下面分别作简要推导并予例证。

2.1 淌度谱和淌度比例谱

WMS按公式(3)和(12)以加权淌度分离分子和离子,由实时测量Q值作图,因此与文献之有效淌度谱[21]不同:后者只针对离子,以μem=μsum-μos绘制谱图,由时间谱转换而来;前者以实测Q绘制μ的实时谱,不分离子、分子。为高精度测得μ-谱,应弃用μ=LR/(Et)测量而改用μ=σVR/Q测量,其中σVR亦须用已知μ之组分表征测得。与时间谱图(见图1a、图2a)不同,WMS能抵抗E的变化(见图1b),但不能抵抗管参数VR等(见图2b)的变化。

进一步提高淌度谱重现性的方案是做加权淌度比例谱(weighted mobility ratio spectrometry, WMRS):

(14)

式中下标IS表示内标,最后一项表明可以直接用电渗做内标。比例谱能抵消对分子和分母有相同程度影响的各种因素,但不能抵消影响程度不同的因素。另外,比例谱是非实时的,除非QIS超稳定且能事先表征出来。

图 1 电场强度对CE-LIF之(a)时间、(b)加权淌度、(c)迁移电量和(d)电荷密度谱图的影响Fig. 1 Impact of electric field strength on (a) time, (b) weighted mobility, (c) migrated charge and (d) charge density spectra measured by CE-LIF CE-LIF: capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detection. Capillary: 7 cm/13 cm (LR/total length)×50 μm ID; buffer: 5 mmol/L borax at pH 9.20; sample: fluorescein (FITC)-derived amino acids. The time spectra were measured in my lab by Dr. GUO Chao while the others were recalculated and replotted according to equation (12).

图 2 (a)时间、(b)加权淌度、(c)迁移电量和(d)电荷密度谱随毛细管和电场的变化Fig. 2 Changes of (a) time, (b) weighted mobility, (c) migrated charge and (d) charge density spectra with capillary size and electric fieldThe conditions are the same as in Fig. 1.

图 3 电泳缓冲液浓度对(a)加权淌度谱、(b)迁移电量谱、(c)电密度谱和(d)摩尔电密度谱的影响Fig. 3 Impact of buffer concentration on (a) weighted mobility, (b) migrated charge, (c) charge density and (d) molar charge density spectraThe other conditions are the same as in Fig. 1.

2.2 迁移电量谱、电密度谱和摩尔电密度谱

加权淌度谱定义明确,但需经Q计算,不如直接做电量谱或Q-谱简便。由公式(12)可知,Q和μ数学等价,亦可抗拒电场影响。比较图1c与图1b可见,Q-谱比μ-谱精密,因为μ除Q外还受其他参数精度影响。注意,Q-谱也抵抗不了毛细管和缓冲液参数的变化。比较图2c与图2b及图3b与图3a可见,Q-峰变化还远大于μ-峰,但更有规律,或许更适合于研究管参数和缓冲体系对分离的影响。

比Q-谱更稳定的是电密度谱(ρ-谱)和摩尔电密度谱(g-谱)。若需更换毛细管,则宜用ρ-谱;若需变化缓冲液,则得换用g-谱。由式(12)可知,ρ-谱已从Q-谱中除去了迁移体积,出峰不再受管参数和电场强度的影响(见图2d),但还受缓冲液影响,唯g-谱能抵抗电场、毛细管、缓冲液全部3类因素的影响(比较图3a、b、c与图3d)。由式(12b)可知,gR只与缓冲液中的参数有关,突出了样品μ的变化,更适合于研究分离效果如何随缓冲液参数的影响。实时测量g-谱需要事先表征或计算cefbVR参数。

g-谱尚未见文献报道,而ρ-谱有类似的MI谱[11]。不过比较公式(12)和(10)可知,MI仅考虑了i随时间的变化,而ρ-谱考虑l、t的关联变化。

由ρ≈μb/μ可知,凡影响有效淌度的因素必会完全或大部分互相抵消,比如溶液黏度、介电常数、环境温度等。实测表明,ρ-谱受温度影响不到时间谱的一半(见图4)。这种对温控的低要求,有利于CE仪器研制的发展。但需注意,样品和缓冲液电解质的解离与pH和温度的关系甚为复杂,不可能完全抵消,图3d也部分反映了这种差异。

与淌度谱类似,Q-、ρ-和g-谱亦可用比例谱来进一步提高谱图稳定,且互相等价,它们都是淌度比例谱的倒数:

(15)

2.3 扩散系数谱[22]

将爱因斯坦扩散公式:

(16)

代入公式(4),整理得:

(17)

再由公式(12)得:

(18)

即扩散系数D正比于T,但T对kB、σ的影响可被q和QR部分抵消。又电渗已被扣减,故在给定温度时,可测得稳定的扩散谱(见图5)。为简化测量,一般取k=0做纯电泳。更精密重现的测定是扩散系数比例谱:

图 4 温度对迁移时间和迁移电荷密度的影响Fig. 4 Changes of migration time and migrated charge density with temperature Capillary: 50 cm/56.8 cm (LR/total length)×50 μm ID; buffer: 3 mol/L acetic acid and 0.1% (w/v) hydroxyethyl cellulose; sample: 3.0 mg/mL human hemoglobin. The other conditions are the same as in Fig. 1.

图 5 混合样品测得的毛细管电泳扩散谱[22]Fig. 5 Diffusion coefficient spectrum measured from a mixed sample by capillary electrophoresis[22] Capillary: 37 cm/55 cm (LR/total length)×75 μm ID; buffer: 10 mmol/L 3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid at pH 9.00; voltage: 10 kV.

(19)

只需向样品加入一已知扩散系数的内标IS即可。扩散系数谱和扩散系数比例谱均需事后重建。但对于给定系统,若电渗为零或已知,亦可实时测量扩散系数谱。

2.4 液相质谱

由斯托克斯刚性球黏滞阻力系数和质量密度d关系式,可将式(6)变成:

(20)

假设各离子在同种溶液中密度差异可略,则在给定电泳条件下,可以直接实现LMS测量:

(21)

有电渗和相分配时:

(22)

依据上式作LMS需事先用标准样品校正CE系统。为获得高稳定结果,可换做质量比例谱:

(23)

欲使LMS更像MS,可设法“电离”样品成分(A)。容易设想的液相离子化方法是化学衍生离子化(liquid-phase deriving ionization, LDI)。若忽略衍生对A结构的影响,得到的是哑铃型产物A-B,则由式(2)与(20)有:

(24)

式中qA和qB分别为A和衍生基团B所带电荷,rA和rB为两者单独时的溶剂化半径。代入公式(4)并整理后得:

(25)

该公式显示,A-B的大小可由CE直接测得,若rB已知则可求得rA。CE中的样品浓度一般很低,多为良溶液,故高分子会无规卷曲,其溶剂化半径可由Flory公式给出[23,24]:

rA=2Nnrmo

(26)

式中N是单体数目,rmo是单体半径。N与单体之间的斥力有关,无斥力时n=1/2,否则n=3/5。由此可计算A的质量mA:

(27)

图 6 聚乙二醇(5 kD)的(a)LMS和(b)MS谱图Fig. 6 (a) LMS and (b) MS spectra of polyethylene glycol (5 kD)a. recalculated from the data in ref. [25]; b. replotted from ref. [25].

式中mmo是单体残基平均质量。图6显示,LMS(见图6a)与MS(见图6b)[25]完全可比。

3 结论

经理论推导和简明实验例证,可以肯定CE不仅能精密测量,还能像MS一样,做高重现测量。关键在于思路,要采用非时CE测量方案。本文基于电量Q测量,推导并验证了加权淌度谱、电量谱、电密度谱、摩尔电密度谱能做实时测量,而扩散系数谱、液相质谱以及各类比例谱一般须实验后重构。这些方法都在一定条件下能成为超稳定CE,很有发展前景和应用潜力,值得深入研究。

致谢 感谢郭超、郭振朋博士提供有关实验的原始数据。