电针“委中”对多裂肌损伤模型大鼠海马氧化应激的影响*

徐 菁,白玉琢,陈 莉,张 莉△,刘 通

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.广东省第二中医院，广东 广州 510095)

腰痛是全球性的公共健康问题，每年近80%的成年人患有腰痛，发病率逐年升高，经济损失巨大，因而是国内外学者研究的热点[1]。多裂肌在内的脊柱深层肌群在维持腰椎稳定性中发挥核心作用[2]。已有研究证实，腰痛患者的多裂肌存在不同程度的损伤或退变[3-5]。因此，恢复腰多裂肌功能对于维持腰椎稳定和治疗腰痛有重要意义。针灸是治疗腰痛的重要非药物疗法，临床中首选委中穴[6]。本课题组前期研究证实，电针“委中”可从多个方面促进损伤腰多裂肌的再生修复[7-14]。钙调蛋白(Calmodulin，CaM)在细胞内与Ca2+结合后形成Ca2+/CaM复合物，激活下游的钙调蛋白激酶CaMKⅡ，对机体细胞的功能活动进行调节。骨骼肌损伤后，Ca2+/CaM/CaMKⅡ通路激活并产生炎症和氧化应激反应[15-18]。本研究选择腰多裂肌损伤大鼠模型，以CaM/CaMKII/iNOS通路和海马氧化应激为切入点，旨在探讨电针“委中”治疗多裂肌损伤所致腰痛的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究购入北京维通利华实验动物技术有限公司生产的SPF级SD雄性大鼠40只，体质量(280±20)g，许可证号：SCXK(京)2016-0006。大鼠分笼后饲养于北京中医药大学针灸推拿学院动物室，自由进食和饮水，12 h明暗交替周期，室温(20±1)℃，湿度(50±10)%，适应性饲养1周。本研究已通过北京中医药大学动物伦理委员会批准，实验过程中对动物的处理符合2006年度科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂

布比卡因磷酸盐溶液(美国Sigma公司，B5274-1G);大鼠CaM/CaMKII试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，M1003328-48T);大鼠iNOS试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，M1003127-48T);RIPA裂解液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，WB-0071);BCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，BCA01);β-Actin(美国Santa公司，AC001-M);CaM蛋白(英国Abcam公司，ab45689);CaMKII(英国Abcam公司，ab22609);iNOS(英国Abcam公司，ab15323);MDA试剂盒(南京建成生物科技有限公司，A003-1);SOD试剂盒(南京建成生物科技有限公司，A001-3)。

1.3 主要仪器

酶标仪(美国Thermo Scientific公司，Multiskan MK3);自动洗板机(北京拓普分析仪器有限公司，DEM-3);电热恒温培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司，SKP-02.600);离心机(美国Sigma公司，3K18);分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司，UV-2100);恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司，HW·SY11-K);韩式电针仪(南京济生医疗科技有限公司，HANS-200A);华佗牌一次性针灸针(苏州医疗用品厂有限公司，0.30 mm×13 mm)。

1.4 动物分组及造模方法

SD大鼠随机分为空白组、模型1 d组和模型3 d组、电针1 d组和电针3 d组,每组各8只。

采用双侧L4～5水平多裂肌注射0.5%布比卡因溶液复制腰多裂肌损伤大鼠模型。针头贴L4～5棘突骨面刺入注射部位，双侧共4个注射点，每点注射100 μL，注射时间≥3 s，以利于药物的吸收，注射结束后完成造模。

1.5 针刺方法

造模结束后，将大鼠俯卧位固定，电针双侧“委中”(“委中”定位参照李忠仁主编的《实验针灸学》中的常用实验动物穴位图谱)。刺激参数：疎密波(疏波2 Hz，密波100 Hz)，电流强度(1 mA)，留针20 min，每日1次。空白组和模型组不做任何治疗。电针1 d组和电针3 d组，在取穴和刺激参数上相同，只是干预时间有差别，电针1 d组为电针干预1 d后取材，电针3 d组为电针干预3 d后取材。

1.6 动物取材

各组大鼠在治疗1 d、3 d后同步取材。使用10%水合氯醛(350 mg/kg,iP)麻醉后断头处死，无菌条件下冰盘上迅速分离取出大鼠海马组织，液氮中保存待测。

1.7 观察指标及方法

1.7.1 各组大鼠海马组织中CaM、CaMKII、iNOS的含量 使用ELISA法检测海马组织中CaM、CaMKII、iNOS的含量：①将标准品6 000～10 000 r/min离心30 s后倍比稀释；②将标准品和样品溶液等量加入标记好的孔板中，混匀后37℃温育0.5 h；③每孔依次加入等量的酶标试剂后37℃温育0.5 h；④每孔依次加入等量的底物溶液后，37℃避光显色10 min；⑤加入等量的终止液终止反应5 min后，使用酶标仪依序测量各孔的光密度(OD值)；⑥使用软件“CurveExPert1.3”分析数据，计算样品CaM、CaMKII、iNOS的含量。

1.7.2 各组大鼠海马组织中CaM、CaMKII、iNOS的蛋白表达 Western blot法检测海马组织中CaM、CaMKII、iNOS的蛋白表达。

1.7.2.1 蛋白提取 将海马组织研碎后加入PBS漂洗，然后加入预冷的RIPA裂解液冰上裂解30 min后超声粉碎，12 000 r/min 4℃离心10 min，吸取上清蛋白液，-20℃保存备用。

1.7.2.2 蛋白定量 根据BCA法依次加入所需浓度的BCA试剂的A、B工作液，振荡混匀后，37℃下放置30 min，测定OD值。

1.7.2.3 制胶 根据样品所需浓度，配制分离胶后灌胶，待其充分聚合。

1.7.2.4 蛋白电泳 样品中分别加入等体积的上样缓冲液混匀后煮沸10 min后电泳，电泳后胶片室温摇床上染色至胶面出现明显的蓝色蛋白条带。

1.7.2.5 转膜 根据样品蛋白浓度进行80 V恒定电压的SDS-PAGE转膜。

1.7.2.6 封闭及杂交 加入一抗溶液，室温下摇床孵育3 h后TBST洗膜，加入二抗溶液，室温摇床孵育2 h后TBST洗膜。

1.7.2.7 曝光鉴定 曝光、显影、扫描后使用Quantity One软件分析目标条带的光密度值，计算样品CaM、CaMKII、iNOS的蛋白相对表达量。

1.7.3 各组大鼠海马组织中MDA浓度和SOD活性 生物化学法检测各组大鼠海马组织中MDA浓度和SOD活性。

1.7.3.1 MDA浓度检测 ①依照试剂盒配制标准品和试剂，4℃冷藏保存；②依序加入标准品、试剂和待测样品后充分混匀；③95℃水浴锅开盖煮沸试剂40 min；④流动水冷却试剂后，3 500～4 000 r/min离心10 min，提取上清液，根据吸光度值计算样品MDA浓度。

1.7.3.2 SOD活性检测 ①依照试剂盒配置所需试剂(缓冲液、底物贮备液、酶贮备液、酶稀释液)，2～8℃保存；②依序在孔板中加入试剂和样品，充分混匀；③各孔溶液37℃孵育20 min，根据吸光度值计算样品SOD活性。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠海马组织中CaM、CaMKII、iNOS含量比较

表1示，与空白组比较，模型1 d组和模型3 d组海马CaM、CaMKII含量显著升高(P<0.01), iNOS含量升高(P<0.01或P<0.05)；与模型1 d组比较，电针1 d组海马的CaM含量降低(P<0.05), iNOS、CaMKII含量显著降低(P<0.01)；与模型3 d组比较，电针3 d组海马的CaM含量显著降低(P<0.01), CaMKII、iNOS含量降低(P<0.05)；与电针1 d组比较，电针3 d组海马的CaM、CaMKII含量显著降低(P<0.01)，iNOS含量虽有降低但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠海马CaM、CaMKII、iNOS含量比较

2.2 各组大鼠海马组织中CaM、CaMKII、iNOS蛋白表达量比较

表2示，与空白组比较，模型1 d组和模型3 d组海马的CaM、CaMKII、iNOS蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型1 d组比较，电针1 d组海马的CaM、iNOS蛋白表达量变化明显(P<0.01)，CaMKII蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)；与模型3 d组比较，电针3 d组海马的CaM蛋白表达量显著变化(P<0.01)，CaMKII蛋白表达量降低(P<0.05)，iNOS蛋白蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)；与电针1 d组比较，电针3 d组海马的CaM、CaMKII蛋白表达量升高(P<0.05), iNOS蛋白表达量降低(P<0.05)。见图1。

表2 各组大鼠海马CaM、CaMKII、iNOS蛋白表达量比较

2.3 各组大鼠海马组织中MDA浓度和SOD活性比较

表3示，与空白组比较，模型1 d组和模型3 d组海马的MDA浓度显著升高(P<0.01), 模型1 d组海马的SOD活性显著降低(P<0.01), 模型3 d组海马的SOD活性升高(P<0.05)；与模型1 d组比较，电针1 d组海马的MDA浓度显著降低，SOD活性显著升高(P<0.01)；与模型3 d组比较，电针3 d组海马的MDA浓度显著降低(P<0.01)，SOD活性差异无统计学意义(P>0.05)；与电针1 d组比较，电针3 d组海马的MDA浓度和SOD活性差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠海马MDA浓度和SOD活性比较

3 讨论

机体损伤不只局限于组织局部，中枢神经系统也会做出反应。骨骼肌损伤后，首先引起损伤局部肌纤维的病变和炎症反应。随着骨骼肌损伤的加重，炎症范围扩大，局部蓄积的炎性细胞因子、组织胺等有害物质会形成伤害性刺激信号，通过神经通路逐级向上传递。海马组织是接受、处理伤害信号的一个高级中枢，参与骨骼肌损伤后的炎症反应的中枢调控。因而，多裂肌损伤后海马组织的病理改变是研究布比卡因引起的多裂肌损伤所致的腰痛发病机制的一个重要思路。机体损伤后细胞内外环境中Ca2+的变化在一定程度上反应了机体损伤的程度。因此，Ca2+/CaM/CaMKII信号通路的变化可能是多裂肌损伤后评估海马组织损伤状态的指标。组织细胞损伤后产生氧化应激病理反应，MDA和SOD作为反应组织细胞抗氧化能力的经典指标，用来评估海马组织损伤的程度。在腰多裂肌损伤所致的腰痛模型中，笔者以伤害性刺激信号传递的高级中枢-海马组织为立足点，结合Ca2+/CaM/CaMKII信号通路，观察海马组织抗氧化能力的变化，以揭示多裂肌损伤型腰痛的发病机制以及电针“委中”的治疗效应，拟从新的角度阐释电针“委中”治疗腰痛的效应机制。

骨骼肌损伤后，肌纤维大量变性坏死，肌细胞内的Ca2+浓度急剧升高，Ca2+与CaM特异性的结合后促进了单核巨噬细胞、淋巴细胞等功能，加重了肌纤维的损伤，在骨骼肌的急性炎症反应中，Ca2+/CaM信号通路发挥了重要作用[19]。CaMKII作为Ca2+/CaM信号通路的下游信号分子，主要传递骨骼肌损伤后的炎症信号。CaM和CaMKII在海马皮质等脑组织中含量比较丰富。生理条件下，CaM和CaMKII可以调节脑内神经元的代谢、突触连接和神经递质合成等活动。病理条件下，神经元的钙超载可以激活CaM和CaMKII。而过度激活的CaM和CaMKII反过来又加重钙超载和神经元的损伤[20]。过度激活的CaM和CaMKII不仅引起细胞的凋亡[21]，同时引起细胞内蛋白质和脂质物的代谢失衡，产生大量的自由基，引起细胞的氧化应激损伤[22]。NO是一种重要的炎性介质，也是Ca2+/CaM/CaMKII信号通路的重要下游信号分子，组织损伤后通过巨噬细胞分泌，可以引起细胞的氧化应激损伤，在神经组织中主要由iNOS诱导后产生[23]，iNOS的变化可以反映海马NO的状态，间接反映海马组织的氧化应激损伤程度。

MDA是细胞发生氧化反应后生成的细胞毒性物质，MDA浓度是反应细胞氧化应激损伤程度的重要标志物。SOD是细胞内重要的抗氧化酶，SOD活性的强弱直接反映了机体的抗氧化能力[24-28]。本研究通过观察腰多裂肌损伤后大鼠海马组织CaM/CaMKII/iNOS通路内CaM、CaMKII、iNOS含量和蛋白表达的变化以及MDA浓度和SOD活性的变化。结果发现，大鼠腰多裂肌损伤后海马组织存在CaM/CaMKII/iNOS通路的激活和海马组织抗氧化损伤的能力降低，二者存在相同的趋势。由此说明大鼠腰多裂肌损伤后，CaM/CaMKII/iNOS通路激活可能是引起海马氧化应激损伤的1个原因。

委中穴是足太阳膀胱经的下合穴，临床中广泛应用于治疗下腰痛。委中穴是四总穴之一，主治区域集中于腰背部。所在经脉——足太阳膀胱经循行经过整个后背和腰，腰为肾之府，膀胱和肾互为表里。委中穴位于腘窝正中，这一区域分布有腘静脉(最终汇入下腔静脉)，腘动脉(起于腹主动脉及其分支)，股后皮神经和腓肠肌内侧皮神经(属于骶丛的分支)，这些都和腰背部以及L4～5直接或间接联系，为委中穴治疗腰背部疾病提供了依据[24]。团队前期通过大量研究证实了电针“委中”治疗大鼠腰多裂肌损伤的科学性。本研究成功复制了L4～5多裂肌损伤的大鼠模型，本次研究发现，造模后海马组织中CaM、CaMKⅡ、iNOS的含量和蛋白相对表达量存在上升趋势，海马组织的抗氧化能力降低。电针“委中”治疗后，海马组织中CaM、CaMKⅡ、iNOS的含量和蛋白相对表达量降低，海马组织的抗氧化能力提高。一定程度上说明，大鼠L4～5节段多裂肌损伤后，海马组织存在CaM/CaMKⅡ/iNOS信号通路的激活和氧化应激损伤，海马组织的氧化应激损伤可能和大鼠腰多裂肌损伤后CaM/CaMKⅡ/iNOS信号通路的过度激活有关。电针“委中”治疗可以抑制CaM/CaMKⅡ/iNOS信号通路的过度激活，提高海马的抗氧化能力，这可能是电针“委中”治疗腰多裂肌损伤所致腰痛的部分机制。然而，关于L4～5多裂肌损伤后通过何途径引起海马组织CaM/CaMKⅡ/iNOS信号通路的激活和氧化应激损伤，电针“委中”怎样对这一过程调节，需要今后通过进一步研究来阐释。