果树类黄酮的提取、分离纯化及检测方法

薛晓芳,2，赵爱玲，任海燕，王永康，李登科*，李 毅

(1.山西农业大学果树研究所/果树种质创制和利用山西省重点实验室，山西 太原 030031；2.山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801)

类黄酮(flavonoids)，是一类结构中有2-苯基色原酮的特殊化合物[1]，泛指通过中央三碳链与两个芳香环(A环和B环)相互连接而成的多元酚类化合物，即类黄酮都具有C6-C3-C6的基本结构[2-3]。类黄酮在植物中多与糖结合以苷元(结合态)的形式存在，仅有一少部分以自由态形式存在。依据其芳香环的氧化状态不同,可将类黄酮化合物分为黄酮醇(falvonols)、查尔酮(chalcones)、黄酮(favones)、异黄酮(isoflavones)、花色素(anthocyanins)、原花色素(proanthocyanins)、黄烷酮(flavanones)、黄烷醇(flavanols或儿茶素catechins)等[4]。目前为止，已报道的类黄酮化合物多达9 000种[5]。近年来，由于类黄酮化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等医疗保健功能而受到人们的日益关注[6]。类黄酮是果树的一类重要的次生代谢产物，本文综述了果树类黄酮的提取、分离纯化与含量检测方法等方面的相关研究，并对果树类黄酮未来的研究方向进行了展望。旨在为果树类黄酮开发利用提供理论参考。

1 类黄酮的提取方法

类黄酮的提取技术及提取效率直接影响后续的分离纯化与含量检测等研究。目前，类黄酮化合物的提取方法主要有有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、回流辅助提取法和酶解提取法等。

1.1 有机溶剂提取法

类黄酮化合物易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂中，由于甲醇、乙酸乙酯等具有一定的毒性，故多选择乙醇作为类黄酮化合物的提取溶剂。提取不同树种或同一树种不同品种或不同器官类黄酮化合物的最适乙醇浓度有差异。克热木江·吐尔逊江等(2012)[7]研究发现，提取新疆野苹果果实类黄酮化合物的最佳乙醇体积分数为55%。梁鹏举等[8]采用响应面法优化灰枣中黄酮提取工艺的研究表明，当乙醇体积分数为70%时，实际优化的工艺条件与理论预测拟合程度高。山楂总黄酮、柑橘黄烷酮提取的最适乙醇体积分数分别为：70%和60%[9-10]。此外，当乙醇浓度与其他辅助条件如超声时间、提取温度等达到最佳组合时，可提高提取得率。

1.2 超声波辅助提取法

超声波辅助提取具有操作简便、提取效率高等优点。超声波产生的空化效应可加速细胞壁的破裂，有利于快速释放内容物，从而缩短提取时间，提高提取效率，该方法在生物活性物质的提取方面具有广阔的应用前景。马莉等[11]研究了冬枣黄酮的超声波提取方法，得到了超声波提取冬枣黄酮的最佳工艺：料液比1∶25，乙醇体积分数70%，提取时间30 min。Pan等[12]优化了超声波辅助提取山楂黄酮化合物的工艺条件。李萍等[13]采用常温振荡法、液氮冷冻研磨法、匀浆法和超声法等4种方法提取苹果果实中的类黄酮，结果表明，超声法提取时类黄酮提取率高，方法稳定。王楠等[14]比较了超声波辅助提取法、微波辅助提取法和传统溶剂提取法3种方法提取沙枣黄酮的效果，结果表明超声波辅助提取效果最好。笔者对枣果实、叶片、花等不同器官类黄酮提取发现，采用超声波辅助提取会提高类黄酮得率。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法能显著缩短提取时间，大大提高黄酮产率。王维力等[15]采用微波-双水相法优化了荔枝皮黄酮提取工艺，发现微波辐射时间为90 s，微波功率为270 W时，荔枝皮黄酮得率为20.74%，与模型计算值20.94%的相对误差仅为0.97%。杨洁等[16]采用微波-离子液体辅助提取枣叶黄酮，结果表明当微波功率为195 W，微波时间为12 min时，黄酮提取率最高为3.20%。施昶等[17]研究了微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺，得出微波辐射时间为3.7 min时，山楂叶总黄酮得率最高为8.923%的结论。可看出，不同树种或品种的最佳微波时间差异较大。

1.4 回流辅助提取法

回流提取法由于其操作简单、安全环保、组分提取较完全，因而被广泛应用于果树类黄酮提取中。吴梅青等[18]比较了碱溶液沉法、回流、超声、微波和水提等5种方法对柑橘皮总黄酮提取效果的影响，结果发现，回流提取总黄酮含量大于其他几种方法，其中与超声波辅助提取比较差异不明显，而与其他3种方法差异非常明显。王小双等[19]研究了核桃壳总黄酮提取工艺，结果发现采用超声加回流提取核桃壳总黄酮提取得率为9.13%。超声辅助提和回流辅助提取结合使用，可大大提高提取效率。

1.5 酶解提取法

酶解提取法即通过在提取过程中加入酶发生酶解反应使类黄酮提取效率大大提高的一种提取技术，通常配合有机溶剂进行提取。目前常用的酶有纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶等，其中纤维素酶和果胶酶应用较多。陈建福等[20]研究了纤维素酶辅助提取柚叶总黄酮的工艺，对酶解温度、酶解时间、酶用量和pH值对总黄酮提取率进行了考察，结果表明，各项指标分别为56 ℃、64 min、3%和pH5.5条件下柚叶总黄酮提取率38.62 mg/g与预测值38.79 mg/g的相对误差仅为0.44%。班若男等[21]采用超声波辅助法加纤维素酶法提取冬枣叶片总黄酮，发现纤维素酶用量对黄酮提取率的影响最为显著。

2 类黄酮的分离纯化方法

分离纯化果树类黄酮最常用的方法是大孔树脂法，目前常用的大孔树脂有AB-8、D101、HPD722、HPD400、D301、DM130、HPD-100、HPD-300、NAK-9等，该方法主要以黄酮纯度及树脂纯化过程中的吸附和解吸条件为评价指标。利用大孔树脂对类黄酮化合物的纯化在许多果树上已有报道[22-23]。研究结果表明，AB-8树脂综合性能较好，适于纯化大部分果树类黄酮化合物。另外，采用高速逆流色谱法(HSCCC)[24]、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱[25-26]也可以对类黄酮化合物进行分离纯化。对分离纯化的类黄酮化合物可根据其理化性质及波普数[27]或LC-MS结合核磁共振鉴定其化学结构[28]。

3 类黄酮的检测方法

果树类黄酮含量的检测方法有多种，主要包括分光光度法[29-30]、(超)高效液相色谱法((U)HPLC)[31-32]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[33]、薄层色谱法[34]、毛细管电泳法[35]等。前3种方法应用较多，每种检测技术各有特点。分光光度计法方法简单、使用方便、成本低，但只能粗略测定总类黄酮含量；而色谱法主要用于检测单体组分，例如(U)HPLC法由于其灵敏度高、重复性好而被广泛应用，但该方法成本较高；LC-MS法则可以对已知或未知组分进行定性或定量分析。随着检测技术的不断发展，LC-MS技术已成为代谢组学分析的主流技术[36-37]。代谢组学是检测生物体受扰动或刺激前后或随着植物生长发育进程的大量代谢产物的动态变化，进而阐明生物体代谢相关过程，其研究对象主要是相对分子质量1 000以下的内源性小分子代谢物[38]。果树代谢组学是对果树细胞、组织或器官中所有小分子代谢产物进行定量或定性分析[39-40]，近年来，基于LC-MS方法的代谢组学研究已被广泛应用于果树类黄酮代谢分析中[41-42]，该方法借助庞大的数据库，可检测到的类黄酮化合物种类多，更全面。实际工作中可根据实验目的选择不同的检测方法。

4 几种常见果树的类黄酮含量

果树的叶片、花、果实、种子等不同部位中均含有类黄酮物质，不同发育时期果实类黄酮含量也不同。研究结果表明，叶片、花和种子中的类黄酮含量均高于果实[43-44]，类黄酮含量随着果实发育总体呈下降趋势[45-46]。成熟果实是大多数果树的主要利用部位，对比了12种常见果树成熟期果实总类黄酮含量(表1)。可看出，不同果树的总类黄酮含量差异较大，山楂、核桃青皮、沙棘等的类黄酮含量较高，番石榴、龙眼和杏果实的类黄酮含量较低；果皮和果肉相比，苹果、枣、葡萄、欧李四种果树都是果皮总黄酮含量高于果肉。应加大山楂、欧李、核桃青皮、沙棘等高类黄酮果树的开发利用力度。

表1 不同果树总黄酮含量(平均值)比较(不完全统计)

5 展望

近年来，随着生活水平的不断提高，对果品营养价值和保健功能的关注度越来越高。类黄酮化合物是果树重要的次生代谢产物之一，不仅赋予果品不同的气味与颜色，更重要的是具有多方面的生物活性与医疗保健功能，成为科研工作者研究的热点内容。目前，果树类黄酮化合物的研究主要是提取技术、分离纯化、检测技术、保健功能等方面，果树类黄酮代谢分子机制方面的研究报道仅涉及苹果[57]、柑橘[58]等大宗果树，对大多数果树类黄酮代谢的分子机理方面的研究还不够深入。建议今后开展以下几方面研究：一是建立统一、标准的果树类黄酮化合物分离纯化与检测体系，为精准鉴定评价奠定基础。二是关注采前、采中、采后果品类黄酮化合物含量变化，为加工确定最适采收期，另外研究加工产品加工前后类黄酮含量变化，使功能性产品真正发挥其应有的功能。三是运用现代分子生物学手段，如基因组学、代谢组学、蛋白质组学或多组学相结合等方法研究果树类黄酮化合物代谢机理及调控机制，为提高果实资源开发利用率和创制高类黄酮含量新种质提供理论参考。