LINC00515在浆液性卵巢癌中的表达及与铂类耐药和预后的相关性分析

李永川

卵巢癌是一种女性生殖器官常见恶性肿瘤，好发于绝经期女性，病死率居妇科恶性肿瘤首位。其发病隐匿，缺乏早期筛查方法，卵巢癌进展迅速，多数确诊患者已属晚期且伴随广泛转移，手术不能完全切除[1]。因此目前临床常用肿瘤减灭术加以铂类药物为基础的联合化疗，但其治疗效果不理想，大部分患者一线化疗后出现继发性铂类耐药，导致复发性卵巢癌患者预后极差，至今卵巢癌患者5年生存率不超过30%[2,3]。因此，明确卵巢癌耐药分子机制，对寻找有效耐药逆转剂和新的治疗靶标，提高卵巢癌化疗预后意义重大。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度>200个核苷酸的非编码RNA，基因间长片段非编码RNA(lincRNAs)属于lncRNA的一类，在多物种中保守型很高，可引导染色质修饰符合物到特定基因位点，调控基因表达[4]。铂类药物主要与DNA交联，诱发DNA损伤，lincRNAs可能参与卵巢癌铂类耐药的作用机制[5]，但关于lincRNAs与铂类耐药相关性研究笔者发现尚鲜有报道。因此本研究拟观察LINC00515在浆液性卵巢癌中的表达，以期探究其与铂类耐药及患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2012年2月至2014年1月我院收治的浆液性卵巢癌患者92例，年龄35～72岁，平均年龄(55.25±15.65)岁；其中≥55岁者51例，<55岁者41例。参照2009年国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obsterics,FIGO)卵巢癌恶性肿瘤手术病理分期标准[1]，Ⅰ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期56例。参照WTO标准，肿瘤病理学分级G1+G2级64例，G3级28例。根据肿瘤直径大小分为≥4 cm者18例，<4 cm者74例。按照有无淋巴结转移分有淋巴转移20例，无淋巴转移72例。按照有无远处(肝、肺等)转移分为有远处转移28例，无远处转移64例。根据美国妇科肿瘤学建议分型[6]，分为铂类敏感组(敏感组)50例，铂类耐药组(耐药组)42例，2组患者年龄、肿瘤直径、病理分级及FIGO分期差异均无统计学意义(P>0.05)。患者在卵巢摘除术中收集卵巢癌组织及距离癌症组织>1 cm处正常癌旁组织，所有组织离体后迅速置于液氮中低温保存备用。样品采集均取得患者及其家属知情同意并签字确认，本研究经过医院道德伦理委员会批准通过。

1.2 纳入与排除标准 参照《妇产科学》关于浆液性卵巢癌的诊断[7]。

1.2.1 纳入标准：①病理证实确诊为浆液性卵巢癌的患者；②无既往肿瘤、血栓病史者；③术前未接受全身或局部化疗、放疗及激素药物治疗者；④自愿接受调查研究，并能完成临床记录者；⑤均为首次进行手术，术后进行以铂类药物为基础的联合化疗。

1.2.2 排除标准：①患有严重急、慢性感染性疾病者；②有手术禁忌、不耐手术者；③心、肝、肾等重要脏器功能障碍或其他恶性肿瘤者；④不自愿接受治疗调查研究者；⑤随访资料不完整者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要试剂与仪器：Trizol试剂(货号：R0016，上海碧云天)； PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)(货号：RR037A，TaKaRa)、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(货号：6210A，TaKaRa)；引物由上海生工合成；紫外分光光度计(美国 Thermo 公司)、RT-qPCR仪7500(美国Bio-Rad公司)等。

1.3.2 实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法检测患者卵巢组织中LINC00515的表达水平：采用Trizol法提取卵巢组织样品总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度。反转录得到cDNA，后将其置于-20℃保存备用。采用RT-qPCR法检测LINC00515表达水平。RT-qPCR采用20 L反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 L，cDNA(50 ng/L)2 L，上下游引物(10 mmol/L)各0.8 L，ddH2O 6.0 μl。反应采用两步法，条件设置为：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，共反应40个循环；添加溶解曲线。采用2-ΔΔCT法对卵巢组织中LINC00515的相对表达水平进行定量分析。见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4 铂类药物疗效评定标准 患者初次手术后10 d开始化疗，紫杉醇175 mg/m2、顺铂75 mg/m2，静脉滴注。21 d为1个疗程，根据患者病情共进行6～8个疗程。根据美国妇科肿瘤学建议分型[6]，铂类敏感：初次采用铂类药物为基础的化疗缓解后，停止治疗后超过6个月出现复发者；铂类耐药：初次采用铂类药物为基础的化疗缓解后，停止治疗后6个月内出现复发者；难治性卵巢癌：对化疗无效，或化疗至少6个疗程最好反应为部分缓解或初步稳定。本研究难治性卵巢癌归入铂类耐药组进行研究。

1.5 随访 对浆液性卵巢癌患者化疗缓解后进行电话或门诊随访，随访时间为1～60个月，截止日期为2019年1月31日或患者复发或死亡时间。

2 结果

2.1 癌旁与卵巢癌组织中LINC00515的表达比较 与癌旁组织比较，浆液性卵巢癌患者卵巢癌组织中LINC00515表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 敏感组和耐药组浆液性卵巢癌组织中LINC00515的表达比较 与敏感组比较，耐药组浆液性卵巢癌患者卵巢癌组织中LINC00515表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 癌旁与卵巢癌组织中LINC00515的表达比较

表3 敏感组和耐药组浆液性卵巢癌组织中LINC00515的表达比较

2.3 LINC00515表达与浆液性卵巢癌患者临床病理特征的关系 以LINC00515表达水平平均数(0.56)为界，将浆液性卵巢癌患者分为LINC00515高表达组(n=53)和低表达组(n=39)。LINC00515在浆液性卵巢癌患者癌症组织中的表达水平与患者的年龄、肿瘤直径无关(P>0.05)，与FIGO分期、病理分级、淋巴转移、远处转移及铂类耐药情况有关(P<0.05)。见表4。

表4 LINC00515在浆液性卵巢癌组织中的表达与临床病理特征的关系 例(%)

2.4 COX分析影响浆液性卵巢癌患者不良预后的危险因素 单因素分析显示，LINC00515、FIGO分期、淋巴转移、远处转移及铂类耐药是患者不良预后的危险因素(P<0.05)。多因素分析显示，LINC00515、远处转移及铂类耐药是影响患者不良预后的独立危险因素(HR=2.569，95% CI为1.727～3.812；HR=1.526，95% CI为1.293～1.801，HR=2.473，95% CI为1.461～4.186；P<0.05)。见表5。

2.5 LINC00515在浆液性卵巢癌患者卵巢组织中的表达与患者总生存率的关系 至随访结束时，浆液性卵巢癌患者死亡65例，存活27例，5年总生存率为29.35%。Kaplan-Meier生存曲线分析发现，LINC00515高表达组浆液性卵巢癌患者5年存活率为41.51%，LINC00515低表达组浆液性卵巢癌患者预后5年存活率为15.39%，低表达组存活率显著低于高表达组，差异有统计学意义(χ2=8.533，P=0.0035)。见图1。

图1 LINC00515表达水平与浆液性卵巢癌患者5年生存率的关系

3 讨论

卵巢癌的治疗方案一般根据其组织学分类进行选择，约90%卵巢癌为上皮性卵巢癌，其主要组织类型包括高级别浆液性、低级别浆液性、子宫内膜样、透明细胞和粘液性等[8]。其中高级别浆液性卵巢癌占上皮性卵巢癌2/3以上，高级别浆液性卵巢癌死亡人数占上皮性卵巢癌患者死亡总人数70%～80%[9]。由于卵巢癌位于盆腔深部，发病隐匿，临床缺乏特异性检测指标，早期筛查不易，75%的患者一经发现已进入中晚期[10]。目前上皮性卵巢癌常用治疗方案为全面分期手术或肿瘤减灭术，术后一般采取铂类药物为基础的联合化疗，但卵巢癌患者5年生存率并未显著提高，而铂类耐药是其治疗失败的主要原因[11]。对卵巢癌铂类耐药的发生机制并不明确。因此寻找与铂类耐药相关的分子，探究铂类耐药机制成为目前研究热点。

LincRNA属于lncRNA的一种，在生物体中有转录调控功能[4]，广泛参与肿瘤细胞对DNA损伤的应答[12]，但目前相关研究均处于起步阶段。Lu等[13]研究发现，LINC00515在抗黑素瘤骨髓瘤细胞中高表达。Tian等[14]研究发现，LINC00515在I期肺腺癌组织中低表达。本研究发现，LINC00515在浆液性卵巢癌组织中低表达，且在浆液性卵巢癌铂类耐药组癌组织中低表达，提示LINC00515可能在不同癌症组织中表达模式不同，其低表达可能与浆液性卵巢癌铂类耐药有关，但还需进一步深入研究。

杜晓琴[15]研究发现，Lnc RNA KCNQ1OT1表达与FIGO分期、肿瘤分级和远处转移有关。郭春芳等[16]研究发现，lncRNA NEAT1和CTBP2表达水平与卵巢癌FIGO分期、肿瘤分级和淋巴结转移有关。本研究结果发现，LINC00515在浆液性卵巢癌患者癌症组织中的表达与患者FIGO分期、病理分级、淋巴转移、远处转移及铂类耐药有关，提示LINC00515可能与浆液性卵巢癌患者严重程度有关。进一步分析发现LINC00515低表达组浆液性卵巢癌患者5年存活率显著低于高表达组，提示LINC00515低表达可能与浆液性卵巢癌患者生存率低有关。COX分析进一步分析发现，LINC00515表达水平、远处转移及铂类耐药是影响浆液性卵巢癌患者不良预后的独立危险因素，提示LINC00515低表达可能与浆液性卵巢癌患者预后差及铂类耐药有关。

综上所述，LINC00515在浆液性卵巢癌卵巢组织中低表达，其表达水平与患者铂类耐药及预后有关。