甘露糖结合凝集素基因多态性及血清表达与慢性阻塞性肺疾病患者急性加重的相关性研究*

苏日娜，李水霞，高 扬，张 毅，马显军，孙丽蓉

(内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院,内蒙古 包头 014030)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持续气流受限为特征的、可预防和治疗的常见病，气流受限呈进行性发展，与气道和肺部对有害气体或有害颗粒的慢性炎症反应有关。COPD患者平均每年会发生1～3.5次的急性加重[1]。每一次的急性加重将给患者的肺功能、社会及个人经济带来严重的不良影响。据研究70 %的急性加重患者由感染引起。甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)是天然免疫系统中重要的模式识别受体，可通过结合暴露在侵入细菌表面的甘露糖而激活补体系统，具有促进调理吞噬、调节炎症过程及启动细胞凋亡等多种功能，能帮助机体防御抵抗多种病原微生物的感染[2-3]。MBL基因突变可干扰形成稳定功能的蛋白多聚体，致体内MBL血清水平下降，降低机体免疫防御和免疫监视能力，增加人体对各种病原体感染的遗传易感性，如MBL缺陷个体易患非囊性纤维化导致支气管扩张，MBL水平低于200 ng/mL与肺部病理改变损伤程度、入院次数及疾病进展相关[4]。本研究通过了解COPD患者MBL基因多态性及其血清表达水平，探讨MBL2第54位密码子多态性是否会影响MBL水平、COPD急性加重及易感性，为COPD急性加重的防治提供新思路。

1 对象与方法

1.1对象 纳入内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院呼吸科2013年1月至2014年12月住院诊治的COPD患者63例(COPD组)，男38例、女25例，年龄(68.5±8.3)岁，均符合COPD诊断标准，处于稳定期。其中COPD反复加重组30例、COPD非反复加重组33例。同期内本院体检健康者54例(对照组),男32例、女22例，年龄(65.9±7.7)岁。两组年龄、性别比例差异无统计学意义(P>0.05)。所有入组患者均了解本研究的目的和内容，签署知情同意书。

1.1.2诊断标准 COPD诊断标准参照2013年COPD诊断指南。COPD急性加重是指COPD患者的呼吸系统症状在短时内恶化，需要改变日常治疗方案。COPD反复加重即入选2年内急性加重的次数≥2次，COPD非反复加重即入选2年内急性加重次数<2次。

1.1.3排除标准 支气管哮喘、支气管扩张及矽肺等慢性呼吸系统疾病者，其他系统遗传倾向病史的患者。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器 血液基因组DNA抽提试剂盒、PCR引物、Taq DNA聚合酶、内切酶BshN Ⅰ、DNA Marker、MBL酶联免疫吸附测定试剂盒(生工生物工程股份有限公司)，PCR扩增仪PE480。

1.2.2标本采集及处理 使用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetracetic acid，EDTA)抗凝管采集COPD稳定期患者及健康者晨起空腹外周静脉血3 mL，血液经4 000 r/min离心取血清，标本保存于-70 ℃待测。

1.2.3聚合酶链式反应(PCR) 按试剂盒说明书进行。PCR引物的设计根据参考文献[5]而合成(生工生物工程有限公司)。MBL-54上游引物：5′-GTAGGACAGAGGGCATGCTC-3′，下游引物：5′-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3′。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，10 μmol/μL上游引物2.0 μL，10 μmol/μL下游引物2.0 μL，DNA模板2.0 μL，蒸馏水19.0 μL。MBL2 PCR反应条件：预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min/1kb，延伸72 ℃ 7 min。MBL-54重复35个循环,末次循环后再72 ℃延伸7 min，4 ℃存放备用。

1.2.4限制性内切酶片断长度多态性(RFLP)技术 MBL2-54酶切反应体系：灭菌去离子水18.0 μL，10×内切酶缓冲液2.0 μL，PCR产物10.0 μL，内切酶2.0 μL(BshN Ⅰ)，总体积32.0 μL。按上述顺序将各成分分别加入到0.5 mL EP管中，瞬时离心；所有加样过程均在冰盒上操作，以防止内切酶活性降低；BshN Ⅰ内切酶的酶切反应条件均为37 ℃，将各反应管放EP管架上37 ℃电热恒温水槽中保温6 h。酶切结果判断：MBL2基因外显子1区第54位密码子PCR产物为329 bp的碱基片段，含A等位基因的片段包含限制性内切酶BshN Ⅰ酶切位点，可被酶切为245 bp、84 bp两个片段，含B等位基因的片段不能被酶切，显示为329 bp一条带，BB型为329 bp一条带，AB型为329 bp、245 bp、84 bp三条带，AA型为245 bp、84 bp两条带。

1.2.5血清MBL水平的测定 按试剂盒说明书操作，最后用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)，MBL浓度与OD450值之间呈正比关系，最后可通过绘标准曲线计算出样品中的MBL水平。

1.3统计学分析 所有数据用SPSS 18.0统计分析，正态分布计量资料用(均数±标准差)表示，非正态分布的计量资料用百分位数(P25,P75)和极值(最大值和最小值)表示。组间基因型和等位基因在组内构成比的差别，采用卡方检验。组间血清MBL水平比较用秩和检验。COPD反复急性加重组与非反复急性加重组MBL基因型的关联强度用Logistic回归模型计算相对风险度的比值比(OR)及95 %可信区间(CI)。所有分析均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1 COPD组与对照组MBL2基因型及等位基因频率分析

2.2COPD组与对照组MBL水平比较 COPD组MBL水平低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 COPD组与对照组血浆MBL水平比较(ng/mL)

2.3COPD组不同基因型的血清MBL水平分析 AB及BB基因型的MBL水平低于AA基因型。MBL2基因第54位密码子多态性会导致血清MBL水平下降。见表3。

表3 63例COPD组患者不同基因型的血清MBL水平分析(ng/mL)

2.4COPD组不同基因型的COPD急性加重次数的比较 COPD反复加重组与非反复加重组两组基因型分布、等位基因频率在两组间分布均具有统计学差异(P<0.05)，其中，B等位基因在COPD反复加重组的频数高于COPD非反复加重组。另外，本研究发现MBL2基因第54位密码子多态性与COPD急性加重相关，B等位基因及BB、AB型基因携带者COPD急性加重的可能性大。见表4和表5。

表4 COPD反复加重组与COPD非反复加重组MBL2基因型频率分析

表5 COPD反复加重组与COPD非反复加重MBL2不同基因型相关分析

3 讨论

COPD是常见的慢性呼吸系统疾病，COPD急性加重会加快肺功能下降速率，降低患者生命质量，增加患者死亡率，给社会经济带来负担，感染是其主要原因。

人MBL基因位于第10号染色体，包括MBL1和MBL2两个基因，其中MBL2基因有编码功能。MBL2基因包含4个外显子和3个内含子。MBL2启动子区域-550、-221、+4位点和外显子1区第52、54、57位密码子共6个单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)以及由多个位点SNP组合而成的单体基因型是影响人MBL血清水平和功能的主要因素[6]。目前MBL2基因多态性研究较多的是SNP，外显子1区的第52、54、57位点的多态性，分别以D、B、C(统称为O)代表这3个位点突变的等位基因，对应于正常型(A)。国外学者对第54位点多态性与疾病的关系研究较多，该位点是由甘氨酸被天冬氨酸替代所致，在健康人群中血清MBL的水平主要受它的多态性的影响。基因型不同，相应的MBL表达水平也不相同。MBL正常功能与其血清表达水平密切相关，若血清MBL浓度过低，循环中的MBL分子多以单体形式存在，不能有效抵抗入侵的病原体，表现为不明原因的反复感染或感染的持续时间延长。不同的民族或人种中MBL基因各关键位点的SNP和常见基因型不同，不同的基因型血液循环中MBL水平差异大，从而造成不同人群对疾病易感性也不同。

研究表明，MBL2基因多态性会影响血清MBL水平，MBL2基因多态性与COPD发病相关[7]。本实验发现，内蒙古包头地区汉族人存在MBL2基因第54位密码子多态性，但COPD组和对照组基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)，提示COPD患者与正常人群的MBL2基因第54位密码子基因型无差异，也有可能是同一基因存在多位点多态性有相互调节作用，单个位点多态性影响作用小所导致的结果。

研究发现，缺乏MBL将增加COPD、哮喘等疾病的易感性[8]，导致机体反复感染[9-10]。MBL缺乏还与中耳炎、肺炎及败血症等的易感性增加有关[11]。有研究却发现MBL缺乏与COPD发病不存在相关性[12]，结论有争议。本研究中COPD患者MBL水平低于对照组，低MBL水平有可能影响COPD发病。此外，本实验中COPD组中AB、BB基因型血清MBL水平比AA基因型低，说明MBL2第54位密码子基因多态性会降低血清MBL水平。

研究表明，由MBL2第54位密码子的多态性引起的MBL缺乏与COPD患者急性加重住院有较强关联。而Albert等[13]以反复急性加重的COPD患者为研究对象进行研究，发现只有1.9 %的患者MBL水平低于正常水平，且研究中没有发现MBL水平与COPD急性加重频率有相关性。这与Yang等[5]报道结果相反。本实验发现COPD组中AB、BB基因型血清MBL水平比AA基因型低，MBL2多态性与COPD患者急性加重次数相关，AB、BB型基因携带者COPD急性加重频率较AA型高，B等位基因可能是COPD急性加重的易感基因。本研究结果与Yang等[7]研究结果易感基因相同，与Albert等[13]研究结论不一致，这可能由种族及地区之间差异造成，也可能是抽样误差所致，可通过增加样本量来减少误差。本研究的样本量较小，有待增大样本量或进行多个SNP位点同时分析来完善研究结果，以探究COPD及COPD急性加重的发病机制。