5-Aza-CdR对HT22小鼠海马神经元细胞中NR2B磷酸化的影响*

姜树原，王 强，张晓璐，刘 友，邵 国,3

(1.内蒙古科技大学包头医学院内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室，内蒙古 包头 014040;2.内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院；3.首都医科大学低氧医学研究所)

N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDARs)在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，而且对神经元回路的形成也发挥关键作用。NR是由多个NR2亚单位与NR1共同形成四聚体(或五聚体)。NR1是构成离子通道的基本亚单位，NR2是调节亚单位，不同NR2组成的NMDA受体表现出不同的脑内分布与生理学特性。在成人脑中，NR2A和NR2B亚基主要在皮层和海马中表达[1-2]。小鼠前脑过表达NR2B，会提高其学习记忆能力而在各种行为任务中表现优异[3]。

NR2B-Y1472的磷酸化与突触可塑性和行为密切相关。经过水迷宫训练，大鼠岛叶皮层突触后致密物(postsynaptic density，PSD)中NR2B-Y1472磷酸化水平升高[4]。5-氮杂-2-脱氧胞苷( 5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)是一种甲基转移酶抑制剂，在表观遗传学研究中被广泛用于抑制DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)的活性。5-Aza-CdR在诱导细胞周期的阻滞、分化、细胞死亡和动物行为学中起到了重要作用[5-8]。我们的研究表明，5-Aza-CdR可以影响小鼠在水迷宫中的行为，由于NR2B及其磷酸化在行为学中也起重要作用，所以，本研究将通过细胞实验探讨5-Aza-CdR对NR2B及其磷酸化的影响。

1 材料与方法

1.1实验细胞 HT22细胞，由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室提供。

1.2药品与试剂 5-Aza-CdR购于美国Sigma-Aldrich公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix均购自日本TaKaRa公司；RIPA细胞裂解液、ECL发光液均购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白酶抑制剂Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail(100×)购自美国Thermo Fisher公司；BCA蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司；兔抗NR2B抗体购自美国CST公司；兔抗p-Y1472 NR2B抗体购自美国Phosphosolutions公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的驴抗兔二抗购于北京博奥森生物技术有限公司；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒均购自美国Promega公司。

1.3实验仪器 ABI 7900 PCR仪购置于美国ABI公司；CantoⅡ流式细胞仪购于美国BD公司。

1.4细胞培养与分组 将小鼠海马神经元细胞系HT22 接种于6孔细胞培养板中，用DMEM培养基培养HT22细胞，用分化培养基诱导24 h[9]。与此同时，将对照组细胞用0.1 % BSA处理，处理组细胞用10 μmol/L 5-Aza-CdR处理。

1.5RNA的提取和real time RT-PCR4 收集处理组和对照组细胞，Trizol法提取细胞RNA，使用Nanodrop 2000检测RNA的浓度和纯度。取1 μg RNA反转录为cDNA，随后进行PCR扩增。NR2B 上游引物：5'-AACCTTCACCTAGCCCCAG-3'，下游引物：5'-CTCATCCGATTTGGCTCTTTCA-3'；β-actin上游引物：5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3'，下游引物：5'-GGTCATTGATGGCAACAA-3'。使用20 μL反应体系(cDNA 2 μL,引物1 μL,Mix 10 μL,ddH2O 7 μL)进行反应。PCR反应条件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,40个循环(95 ℃ 15 s,59 ℃ 30 s,74 ℃ 30 s)，72 ℃总延伸2 min。Real time RT-PCR结果利用△△CT 法进行分析，mRNA 相对丰度值F = 2-ΔΔCT。

1.6Western Blot 收集处理组和对照组细胞，加入RIPA裂解液(1 mL/mg)裂解细胞，同时加入Thermo Halt(100×)蛋白酶抑制剂至工作浓度，在冰上超声后提取蛋白，应用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，取20 μg的蛋白提取物进行 SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上，用5 %脱脂奶粉在室温下封闭1 h后，加入兔抗NR2B、p-Y1472 NR2B、β-actin抗体(所有抗体稀释浓度为1∶500)，4 ℃孵育16 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的驴抗兔二抗(1∶1000)，室温孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min，浸于适量的ECL化学发光剂中，使用Image J分析其灰度值。

1.7MTS检测 将HT22细胞种于96孔板，用5-Aza-CdR或0.1 % BSA处理，根据CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit试剂盒说明书检测细胞活力，每组重复3次。

1.8细胞周期检测 将HT22细胞接种于100 mm 培养皿中，当细胞生长到60 %～70 %时，用5-Aza-CdR或0.1 % BSA处理，按照BD公司试剂盒说明书进行细胞周期实验。使用BD CantoⅡ检测细胞周期，应用ModFit 3.0软件进行分析。

2 结果

2.15-Aza-CdR对HT22细胞中NR2B和磷酸化NR2B -Y1472表达的影响 real time RT-PCR、Western Blot检测结果显示，用0.1 % BSA处理的对照组HT22细胞与用10 μmol/L 5-Aza-CdR处理的处理组HT22细胞比对，处理组与对照组之间NR2B的 mRNA和蛋白水平的变化没有明显差异(P>0.05)。见图1A-B。5-Aza-CdR处理组磷酸化NR2B-Y1472的表达明显高于对照组(P<0.05)。见图1C。

2.25-Aza-CdR对HT22细胞活力和细胞周期的影响 MTS检测结果显示，10 μmol/L的5-Aza-CdR可显著降低HT22细胞的细胞活力(P<0.05)。见图1A。流式细胞术检测结果显示，10 μmol/L的5-Aza-CdR可将HT22细胞阻滞在G2/M期。见图1B-C。

3 讨论

5-Aza-CdR对细胞或组织的影响是一个复杂的机制。DNA甲基化在学习和记忆中发挥一定的作用[10]，我们先前研究发现5-Aza-CdR可以改善小鼠在水迷宫中的学习记忆能力[5]。NR2B和磷酸化NR2B-Y1472在学习和记忆功能中起着关键的作用[10-11]。目前尚不清楚5-Aza-CdR对动物行为的影响是否是由于NR2B-Y1472的磷酸化水平调控的，且不依赖于海马细胞增殖。本研究使用了小鼠海马神经元细胞系HT22细胞进行体外试验，10 μmol/L的5-Aza-CdR可抑制细胞活力，并且细胞周期被阻滞于G2/M期。因此，目前我们认为动物行为能力的增强不是由于神经元的增殖。另外，HT22细胞中5-Aza-CdR处理组NR2B的表达不变，磷酸化NR2B-Y1472表达水平增加。实验数据显示，5-Aza-CdR可影响小鼠行为学的变化与磷酸化NR2B-Y1472的表达变化有关。因此进一步研究5-Aza-CdR调节脑中NR2B-Y1472磷酸化变化分子机制，对于利用5-Aza-CdR治疗学习记忆相关疾病有潜在的临床价值。