lncRNA Hulc和miR-9-5p在乳腺癌中的表达水平及临床意义

黄振宇,杨剑波,凌雪君,赖万强,李艳华

乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因之一,据统计,2018年全世界有乳腺癌新发患者210万例,乳腺癌相关死亡患者63万例,对患者的生命健康构成了巨大的威胁[1]。虽然近年来乳腺癌的治疗取得了一定的进步,但是患者的预后依然不容乐观,还需探索新的乳腺癌治疗手段[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)具有多种生物学功能,被认为是癌症发展中的重要调控因子,有作为癌症候选生物标志物和治疗靶标的潜力[3]。长链非编码RNA肝癌高表达转录本(long non-coding RNA highly upregulated in liver cancer,lncRNA Hulc)最早是在肝癌中被发现,并在肝癌细胞中高表达[4]。许多研究发现,lncRNA Hulc还可以作为癌基因促进包括胰腺癌和胃癌等恶性肿瘤的进展[5-6]。有研究报道lncRNA可以通过竞争性结合微小RNA(miRNA)充当其分子海绵来发挥生物学功能[7],Liu等[8]报道在胃癌中lncRNA Hulc通过充当微小RNA-9-5p(miR-9-5p)的分子海绵来调节细胞的恶性生物学行为。miR-9-5p是与肿瘤密切相关的miRNA之一,在非小细胞肺癌和前列腺癌中发挥促癌作用[9-10],在胃癌和胰腺癌中发挥抑癌作用[11-12]。Majer等[13]测序结果显示miR-9-5p在乳腺癌中可能与肿瘤抑制相关。目前较少关于lncRNA Hulc、miR-9-5p与乳腺癌关系的研究报道,二者在乳腺癌中具体的作用机制尚不明确,在乳腺癌中lncRNA Hulc是否与miR-9-5p相关未知。本研究分析了lncRNA Hulc和miR-9-5p在乳腺癌中的表达水平及临床意义,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取贺州市人民医院2017年1月至2019年1月收治的乳腺癌患者80例,年龄36～70(46.2±9.1)岁;发生部位:左侧39例,右侧41例;T分期:T1期39例,T2期20例,T3期17例,T4期4例;淋巴结转移:有33例,无47例;临床分期:Ⅰ期24例,Ⅱ期19例,Ⅲ期19例,Ⅳ期18例;雌激素受体(ER)阳性48例,阴性32例;孕激素受体(PR)阳性35例,阴性45例;人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性20例,阴性60例。纳入标准:①患者初次行手术治疗;②未接受过任何形式的抗肿瘤治疗;③经病理检查确诊为乳腺癌;④临床病理信息完整;⑤未发生远处器官转移;⑥患者及家属签署知情同意书。排除标准:①合并其他类型肿瘤者;②合并严重的心、肝、肾及肺功能障碍者;③患有传染性疾病者。本研究遵循赫尔辛基宣言,并经我院伦理委员会审核通过。

1.2 实验试剂与仪器 组织RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司,三氯甲烷、异丙醇和纯酒精等相关试剂购自天津风船化学试剂科技有限公司;Bestar 1stStrand cDNA合成试剂盒购自上海DBI® Bioscience公司;SYBR Premix EX TaqTM转录试剂盒购自日本TAKARA公司;lncRNA Hulc、miR-9-5p和内参U6引物由上海捷瑞有限公司合成;Nanodrop 2000分光光度仪购自美国Thermo公司;7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 组织中总RNA提取 组织标本离体后立即置于液氮中冻存,经液氮完全冷冻后放入研钵中研磨成粉末,并加入1 ml Trizol试剂完全裂解,移至EP管中加入200 μl三氯甲烷混匀后静置5 min,4 ℃ 12 000 r/min离心30 min,可见溶液分为3层,最上层为澄清的水相层,将其吸取450 μl，与等体积的异丙醇混匀后,于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,纯酒精洗涤两次后可见白色沉淀,用DEPC水将其溶解后即获得组织总RNA,用Nanodrop 2000检测RNA的浓度和纯度,放置-80 ℃保存。

1.4 实时荧光定量PCR检测lncRNA Hulc和miR-9-5p的相对表达量 按照反转录试剂盒说明书配制反应体系20 μl,包括Enzyme Mix 1 μl、5×RT Buffer 4 μl、Primer Mix 4 μl、无RNA酶水 11 μl。按照37 ℃ 15 min,85 ℃ 30 s扩增条件将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板,按照ULtraRT One Step RT-PCR Kit试剂盒说明书配制实时荧光定量PCR反应体系10 μl,包括cDNA模板2 μl、SYBR Premix EX TaqTMⅡ4 μl、上下游引物各0.4 μl(lncRNA Hulc引物F: 5′-ACCTCCAGAACTGTGATCCAAAATG-3′,R: 5′-TCTTGCTTGATGCTTTGGTCTG-3′;miR-9-5p引物F: 5′-ACACTCCAGCTGGGAGTATGTCGATCTATTG-3′,R: 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;内参U6引物F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R: 5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′)、ROX Reference Dye 0.2 μl、ddH2O 3 μl。PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火延伸30 s,共40个循环。获得各样品的循环阈值(Cycle threshold,Ct)。以U6基因为内参,用2-ΔΔCt公式计算lncRNA Hulc和miR-9-5p的相对表达量。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织中lncRNA Hulc和miR-9-5p表达水平比较 乳腺癌组织中的lncRNA Hulc表达水平高于癌旁组织,miR-9-5p表达水平低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 乳腺癌组织与癌旁组织中lncRNA Hulc和miR-9-5p表达水平比较

2.2 乳腺癌组织中lncRNA Hulc、miR-9-5p的表达水平与患者临床病理参数之间的关系 T3+T4期乳腺癌患者的lncRNA Hulc表达水平高于T1+T2期乳腺癌患者，Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌患者的lncRNA Hulc表达水平高于Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者，有淋巴结转移者的lncRNA Hulc表达水平高于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、发生部位、ER、PR和HER2患者的lncRNA Hulc表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌患者的miR-9-5p表达水平低于Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者，有淋巴结转移者的miR-9-5p表达水平低于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、发生部位、T分期、ER、PR和HER2患者的miR-9-5p表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 lncRNA Hulc、miR-9-5p在乳腺癌组织中的表达水平与临床病理参数之间的关系

2.3 乳腺癌组织中lncRNA Hulc与miR-9-5p的相关性分析 在乳腺癌组织中,lncRNA Hulc与miR-9-5p的表达呈负相关(r=-0.472,P=0.003),见图1。

图1 乳腺癌组织中lncRNA Hulc和miR-9-5p表达的相关性

2.4 lncRNA Hulc和miR-9-5p对乳腺癌淋巴结转移的预测价值 lncRNA Hulc和miR-9-5p对乳腺癌淋巴结转移均具有较高的预测价值,敏感度和特异度均高于0.7。lncRNA Hulc和miR-9-5p联合应用对乳腺癌淋巴结转移的敏感度和特异度分别为0.818、0.809,其诊断效能明显高于单一指标,见表3、图2。

图2 lncRNA Hulc和miR-9-5p预测乳腺癌淋巴结转移的ROC曲线

表3 lncRNA Hulc和miR-9-5p对乳腺癌淋巴结转移的预测价值

3 讨论

外科手术是早期乳腺癌的主要治疗方法,可提高长期生存率,晚期乳腺癌的主要治疗方法包括连续内分泌治疗、化疗和生物疗法,但疗效欠佳[14-15]。转移是乳腺癌患者死亡的主要原因,其可转移至肝、骨和肺等重要器官,发生转移患者的5年生存率则会明显降低[16]。靶向疗法是新近研发的治疗手段,在乳腺癌的治疗中取得了较大的进展,但是由于肿瘤细胞具有耐药性,导致患者的预后达不到预期的效果[17]。目前肿瘤学研究越来越重视寻找影响肿瘤细胞存活、增殖和转移的关键分子,通过调节这些分子的表达来达到抗肿瘤的目的。此外乳腺癌的发病机制尚未完全明确,研究乳腺癌发病过程中发挥关键作用的分子是乳腺癌治疗的重要方向。

在人类基因组中,只有2%的蛋白质编码基因被稳定转录,而绝大多数是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),新兴证据表明ncRNA特别是lncRNA和miRNA可以通过调节编码基因的表达和表观遗传学特征在各种类型的癌症中发挥至关重要的作用[18]。lncRNA包含200多个核苷酸,调控多种生物学功能,例如调节蛋白质和RNA的稳定性、转录调节和指导蛋白质与DNA的相互作用等[19]。越来越多的lncRNA在乳腺癌中被报道[7],其中lncRNA Hulc在乳腺癌组织和细胞系中呈高表达,且lncRNA Hulc可通过互补碱基配对直接结合miR-6754-5p,从而促进乳腺癌的侵袭和迁移能力[20]。同时lncRNA Hulc在胰腺癌患者的组织和血清中也呈高表达,且lncRNA Hulc表达与包括肿瘤大小、T分期、M分期和血管侵袭在内的病理参数有关,是胰腺癌诊断和预后评价的标记物[5]。本研究发现lncRNA Hulc在80例乳腺癌组织中表达上调,并且lncRNA Hulc表达与乳腺癌患者T分期、淋巴结转移和临床分期相关,与Wang等[20]的报道一致,提示lncRNA Hulc可能参与了乳腺癌的发生发展。miR-9-5p在不同肿瘤中发挥的作用不一致,既可以发挥促癌作用,又可以发挥抑癌作用,Majer等[13]使用下一代测序(NGS)技术鉴定了包括miR-9-5p在内的7个miRNA与乳腺癌中的肿瘤抑制有关,而miR-9-5p在乳腺癌中的表达情况尚不清楚。本研究结果显示miR-9-5p在乳腺癌组织中呈低表达,且其表达水平与患者淋巴结转移和临床分期有关,同样表明miR-9-5p可能参与了乳腺癌的发生发展。在胃癌中lncRNA Hulc的作用机制是通过靶向抑制miR-9-5p表达,进而调控胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化和凋亡[6]。而在乳腺癌中lncRNA Hulc是否可以调控miR-9-5p参与肿瘤的发生发展目前尚不清楚。本研究发现,在乳腺癌组织中lncRNA Hulc与miR-9-5p表达呈负相关,表明lncRNA Hulc可能通过结合miR-9-5p抑制其表达而参与乳腺癌的恶性进程,但是具体的作用需在后续细胞水平进行验证。

淋巴结转移是乳腺癌恶性进展的重要因素,目前有较多医院对于乳腺癌的患者会进行常规腋窝淋巴结清扫,然而并非所有的患者都伴有腋窝淋巴结转移,未发生转移的患者在行腋窝淋巴结切除后局部淋巴系统被破坏,同时手术会留下手术瘢痕,会对患者造成不利的影响[21]。准确预测患者是否发生淋巴结转移,可有效指导临床制定合理的治疗计划。本研究发现lncRNA Hulc和miR-9-5p的表达均与患者的淋巴结转移有关,故进一步行ROC分析了二者对患者淋巴结转移的预测价值,结果显示lncRNA Hulc和miR-9-5p对乳腺癌淋巴结转移均有一定的预测价值,且二者联合应用的预测价值更高,敏感度和特异度分别为0.818、0.809。但组织样本的临床应用价值有限,由于lncRNA和miRNA均可在血液中表达,在后续的研究中将进一步分析二者在血液中的表达及其对淋巴结转移的预测价值。

综上所述,lncRNA Hulc在乳腺癌中高表达,miR-9-5p在乳腺癌中低表达,两者的表达呈负相关,且均与患者不良病理参数相关,并对淋巴结转移有一定的预测价值。lncRNA Hulc和miR-9-5p可能是治疗乳腺癌的候选靶点。