上海虹口区2017-2019 年致泻性大肠埃希菌耐药和分子分型(PFGE)研究

倪春苗 张静 沈静 金宏飞 唐漪灵 王姗

（上海市虹口区疾病预防控制中心 上海 200080）

致泻性大肠杆菌是一种重要的腹泻病病原菌，主要包括肠粘附性大肠杆菌（EAEC），出血性大肠杆菌（EHEC），产毒性大肠杆菌（ETEC），致病性大肠杆菌（EPEC），侵袭性大肠杆菌（EIEC），由它们引起的各类腹泻很大程度地影响着的人类健康，而一旦疏于监控，暴发严重疫情，会对公共卫生造成巨大威胁。为此，现将2017 年—2019 年上海市虹口区分离到的致泻性大肠杆菌进行脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分型及药敏性分析，通过其PFGE 型别特征和耐药特点，为临床用药和制定有效防控措施提供依据。

1.方法与实验

1.1 样品来源

医院根据《上海市腹泻病监测试点实施方案》，采集标本后，保存于Cary-Blair 运送培养基，按生物安全运送要求于采样当天送至监测实验室。

1.2 试剂与仪器

麦康凯培养基(科马嘉)；双糖(科马嘉)；检测试剂盒：肠粘附性大肠杆菌（EAEC），出血性大肠杆菌（EHEC），产毒性大肠杆菌（ETEC），致病性大肠杆菌（EPEC），侵袭性大肠杆菌（EIEC）检测试剂盒，（之江生物有限公司）药敏板：革兰氏阴性菌药敏板GN4F（ThermoFisher）蛋白酶K(TaKaRa)；限制性内切酶Xba Ⅰ（TaKaRa）

PCR 仪：宏石实时荧光PCR；水浴培养箱(天能科技)；浊度仪(法国生物梅里埃)；生物安全柜(美国Baker)；GFL 型水浴摇床；凝胶成像系统和PFGE及配套设备(美国Bio-Rad公司)。全自动微生物药敏鉴定仪（Sensititre）

1.3 致泻性大肠埃希菌检测、分离及鉴定参照《上海市腹泻病监测试点实施方案》

标本直接麦康凯（MAC）平板上，36 度培养18 ～24h，挑取5 个可疑菌落进行生化初筛。生化初筛符合后进行荧光定量PC R检测(上海之江科技公司)确证实验。；反应体系：检测混合液35μl，酶0.4μl，H2O1μl,样品4μl。条件：37℃2m，94℃2m，再按93℃15s ～60℃s，进行40 个循环)，反应体系40μl。实验结果判定按照检测试剂盒说明书。PFGE 分型按照美国CDC PulseNet 制定的PFGE 标准，沙门标准菌株H9812 作为分子质量标记，选用限制性内切酶Xba Ⅰ进行酶切。PFGE 图像用BioNumerics 软件根据UPGMA 方法进行聚类分析。实验参数：电压梯度6V/cm，电场夹角120°，脉冲时间6.76 ～35.38s，电泳时间18±1h。

1.5 药敏检测

确认致泻性大肠杆菌的菌株进行肉汤增菌，用比浊仪调到0.5 麦氏单位，在全自动药敏鉴定仪上按照操作规程完成加样、判读.

2.结果

2.1 致泻性大肠在2017 年送检318 份样品，2018 年133 份样品2019 年10 为止是170 份，一共为621 份。在这些感染性腹泻患者粪便标本中，检出85 株致泻性大肠，检出率为13.68%，其中EPEC（30 株）ETEC(41 株)和EAEC(14 株)。

2.2 对80 株菌株做了PFGE 分子分型检测、

其中2017 年44 株，2018 年5 株（2018 年收集的菌株样本比较少，）2019 年31 株。在2017 年出现2 株ETEC 菌株100%的聚类和2019 年出现了2 株EAEC 菌株100%的聚类。其他每个带型仅有1 株菌。PFGE 条带型相似性60%～ 100% 分型结果表明本区致泻性大肠呈高度多态性。如图1

2.3 对60 株菌株做了药敏检测，采用了MIC 法

共做了24 种抗生素的药敏实验，致泻性大肠杆菌对美罗培南（MEM）、亚胺培南(IMP)、阿米卡星（AMI）多粘菌素E和B（CT、PB）完全敏感；对氨苄西林（AMP）、四环素（TET）耐药率高分别为70%和60%，对头孢烯类抗生素(CTX、CEC、CFX、CAZ)中、只有22.%的菌株对CFZ 耐药，其他均敏感。对氨基糖苷类抗生素(KAN、GEN)绝大多数菌株敏感。

3.讨论

3.1 在621 份粪便标本中，检出85 株致泻性大肠，检出率为13.68%，与国内相关报道基本符合[1-2]。

3.2 近年来，由于抗生素的广泛使用，致泻性大肠杆菌耐药性问题日益严重，已经出现了许多多重耐药菌株[3]而虹口地亚安培南（IMI）、美罗培南（MEM）、阿米卡星（AMI）多粘菌素E 和B（CT、P B）完全敏感；孢烯类抗生素(C TX、CEC、CFX、CAZ)中、只有22.%的菌株对CFZ 耐药，其他均敏感。对氨苄西林（AMP）、四环素（TET）耐药率高分别为70%和60%，对氨基糖苷类抗生素(KAN、GEN)绝大多数菌株敏感（这与一些地区报道不一致）[4]。所以由致泻性大肠杆菌引起的腹泻中，在治疗过程中应结合《抗菌药物临床应用指导原则》和本地区该菌耐药特点进行选择，以减少耐药株的产生。

3.3 80 株大肠杆菌出现78 个PFGE 带型，表明虹口区致泻性大肠带型呈现高度多态性，这与其他地区情况一致[5].其中在2017 年和2019 年中分别出现两株PFGE 带型中100%的聚类情况，并且耐药性也很相近，提醒相关部门关注，可能会引起小规模的暴发。。

3.4 通过药敏实验和PFGE 建立本地区的致泻性大肠杆菌基础数据库，结合临床特征、流行病学调查，深入认识虹口地区致泻性大肠杆菌分群特征及整体状况，对本地区致病性的大肠杆菌长期监测、耐药情况的发现、指导临床用药及疫情的预测预防等工作具有重要价值。