miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p在子痫前期发生中的作用及机制研究

周俏苗，汪洪林，岑慧，肖美芳，黄海燕，许晶，施蕾

子痫前期(preeclampsia，PE)是临床常见的一种妊娠期并发症，通常发生在妊娠20～34周期间[1]。PE患者临床主要表现为蛋白尿、高血压及水肿，严重时可导致昏迷、抽搐及心、肾功能衰竭等症状，并可伴随早产，不仅对孕妇本身的身体健康带来影响，还会影响胎儿的生命健康，严重时需要采取人工流产的方式来终止妊娠[2-3]。MicroRNA(miRNA)是一种非编码蛋白质的单链RNA[4]，目前不少研究表明，miRNA与PE的发生及发展有着密切的关系，而miRNA-26a-5p和miRNA-135a-5p在子痫前期发生中的研究少见文献报道。本研究通过分析PE孕妇血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达情况，以期为深入研究PE的发生机制提供新的思路，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年7月—2019年8月海南省妇女儿童医学中心妇产科收治的手术分娩PE孕妇30例为观察组，纳入标准：(1)符合PE 的诊断标准[5]；(2)均为单胎妊娠。排除标准：(1)妊娠期糖尿病者；(2)原发性高血压病者；(3)其他妊娠期并发症者。选择同期孕周匹配的正常手术分娩孕妇30 例为对照组。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

表1 2组基线资料比较

1.2 试剂与仪器 (1)试剂：DNA提取试剂盒由美国Promega公司提供，测序反应试剂由美国ABI公司提供，PCR反应试剂盒由美国Invitrogen公司提供，引物由上海博亚生物技术有限公司提供。 (2)仪器：切片机(型号：OPJ-1B，天津天利航空机电有限公司)、离心机(型号：5424r，美国Eppendorf 公司)、酶联免疫检测仪(型号：DG3022，上海医用分析仪器厂生产)、PCR扩增仪(型号：S100，美国Bio-Rad公司)、显微镜(型号：Olympus IX71，日本OLYMPUS)、电泳仪(型号：Bio-RaD，美国Bio-Rad公司)。

1.3 检测方法

1.3.1 样本采集：采集研究对象入院当天外周静脉血(禁食8 h)5 ml，20℃下静置30 min后，离心机3 000 rpm离心10 min，取上清，置入-80℃冰箱备存。剖宫产胎盘娩出后5 min内，取胎盘组织，剪取中央部位组织块(1 cm×1 cm×1 cm)，无菌生理盐水漂洗，装入EP管并置入-80℃冰箱备存。

1.3.2 qRT-PCR技术检测血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p的表达：取出血清解冻，按照Trizol试剂的说明书提取组织总RNA(纯度比值范围控制：1.8～2.0)，标记miRNA，进行miRNA芯片杂交，并扫描及数据分析。选取miRNA芯片结果中的miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p进行荧光定量PCR分析，采用反转录试剂盒配置反应混合物，反转录合成环状DNA，RT-PCR反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性3 s，60℃退火34 s，40个循环，相关引物序列由上海生工公司提供(见表2)，每个样品目的基因的CT值用内参基因(U6RNA)来进行归一化，获得实验样品和对照样品的△CT值，目的基因相对U6的表达量=2-△CT，最后计算miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p相对表达量2-△△CT。

表2 相关引物序列表

1.3.3 免疫组织化学染色检测胎盘E-cad蛋白表达：将胎盘样品采用4%多聚甲醛固定，行常规石蜡包埋，切片机切成厚度5 μm的切片，常规脱蜡，乙醇梯度浸泡，蒸馏水浸泡5 min后加入3%过氧化氢溶液50 μl， 20℃下孵育10 min，对内源性过氧化物酶的活性进行阻断，PBS冲洗3次(每次5 min)，加入50 μl的一抗(稀释度为1∶300)，4℃下过夜后，加入二抗(稀释度为1∶500)，37℃下孵育15 min，采用DBA试剂进行显色，显色后，苏木素复染2 min，中性树胶封片， 采用光学显微镜下观察各视野染色分布、强度和面积。以PBS代替一抗，作为阴性对照，以细胞膜或细胞浆出现明显的棕黄色染色颗粒为阳性，无着色或与背景染色一致为阴性。采用HMIAS-2000型全自动彩色图像分析系统进行分析，每张切片选取5个视野，测定免疫组化染色的平均光密度值(AOD)，半定量分析E-cad蛋白的表达。

2 结 果

2.1 2组血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达情况比较 观察组血清中miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达明显高于对照组(P<0.01)，见表3。

表3 2组血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达情况比较

2.2 2组胎盘E-cad蛋白表达情况比较 2组E-cad蛋白主要表达于绒毛细胞滋养细胞，其中对照组胎盘滋养细胞可见浅棕黄色阳性染色，观察组胎盘滋养细胞可见大量棕褐色阳性染色，见图1。观察组E-cad蛋白AOD值(0.153±0.014)明显高于对照组E-cad蛋白AOD值(0.186±0.017)，差异有统计学意义(t=8.207，P=0.000)。

2.3 血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达与胎盘中E-cad表达的相关性 经Pearson相关性分析显示，血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达与胎盘中E-cad表达均呈现正相关(r/P=0.531/0.001、0.543/0.004)。

3 讨 论

随着我国二胎政策的开放，妊娠并发症的发生率也在不断增加，其中妊娠高血压是常见的并发症，包括妊娠期高血压、PE及子痫等，其中PE的发病率呈不断增加的趋势[6-7]。在全球范围内，PE的发病率为5%～8%，其主要特征为血管反应异常，表现为血小板聚集增强、系统性血管阻力升高、内皮细胞功能异常及凝血系统激活等，给孕妇及胎儿均带来严重不良影响[8-9]。目前对PE的发病机制仍不清楚，对其发病机制有着不同的假说，包括胎盘浅着床、过度炎性反应、胎盘组织血供改变、内皮细胞功能障碍及滋养细胞凋亡等学说[10]。通常认为胎盘功能异常在PE的发生及发展过程中起到重要作用[11]。

miRNA是一种调节基因表达关键的因子，通过调节众多的靶基因，参与机体免疫应答过程，在自身免疫疾病发生及发展中发挥十分重要的作用[12-13]。miRNA在机体细胞的正常生长及分化过程中起到重要作用，另外还参与了炎性反应和癌变等病理过程，在肝癌、乳腺癌及直肠癌等恶性肿瘤的发生及发展中发挥重要作用[14-15]。在妊娠过程中，滋养细胞侵袭过程与肿瘤细胞浸润过程十分相似，近年研究显示，miRNA在PE的发生及发展过程中亦起着重要作用[16]。miRNA在血液中稳定存在，可检测患者血清观察其表达情况[17]。miRNA-26a-5p在肝癌、膀胱癌、结直肠癌、肺癌及前列腺癌等发病及发展中具有重要作用，通过调控不同的信号转导通路，诱导上皮细胞向间质转化(EMT)而促进癌症的转移[18]。miRNA-135a-5p是miRNA-135 家族的重要成员之一，位于第3号染色体，目前被证实与多种恶性肿瘤的发生有着密切关系[19]。本研究结果显示，miRNA-26a-5p在观察组血清中的表达量是对照组的3.34倍左右， miRNA-135a-5p在观察组血清中的表达量是对照组的3.16倍左右，因此笔者推测，miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p可能参与了PE的发生及发展过程。

滋养细胞侵蚀能力障碍与PE的发生有着密切关系，其机制可能为胎盘浅着床[20-22]。滋养细胞的侵蚀能力主要受其表面黏附分子影响[23]。E-cad是一种可介导滋养细胞间的黏附分子，其具有同种分子相嗜性，会介导同种细胞间的黏附，在上皮细胞表面有着较广泛的表达，对维持上皮细胞层的完整性与极性有着十分重要的作用[24-25]。在PE患者及正常妊娠胎盘滋养细胞均可见E-cad的表达，可作为滋养细胞的标志性蛋白，并随着滋养细胞侵蚀能力的变化而变化，在EMT过程中均发挥重要作用[26]。本研究结果显示，观察组E-cad蛋白AOD值明显高于对照组(P<0.01)，说明在PE患者胎盘组织中滋养细胞之间的黏附能力较强，滋养细胞不易于迁移，侵蚀能力减弱。经Pearson相关性分析显示，血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达与胎盘中E-cad表达均呈现正相关(P<0.01),推测这可能是因为随着miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表达的上调，E-cad的表达也随之明显上调，miRNA-26a-5p和miRNA-135a-5p通过调控E-cad使EMT过程受到抑制，阻碍滋养细胞融合成合体滋养细胞，影响母胎屏障；同时使血管重铸无法有效完成，造成胎盘浅着床，最终引发PE。

综上所述，PE患者血清中miRNA-26a-5p和miRNA-135a-5p异常表达可能参与PE的发病，两者可能通过E-cad调控滋养细胞EMT参与PE的发病机制。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

周俏苗：提出研究方向、研究思路、研究选题，论文撰写，论文审核；汪洪林：设计研究方案、研究流程；岑慧：分析试验数据;肖美芳：进行文献调研与整理，论文修改；黄海燕：进行统计学分析，设计论文框架;许晶：实施研究过程，资料搜集整理