缺血性脑卒中后认知功能障碍患者血清miR-132、miR-135表达与认知功能的关系及其预测价值

刘欣，吉智，李毓新，刘利宁，惠晶

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是全球常见的致死致残性疾病，多见于中老年人，随着我国社会老龄化进程加重，IS发病率逐渐增加[1]，IS后认知功能障碍属于卒中后异常心理行为，认知功能障碍会延缓神经功能恢复，随着年龄增长和疾病进展可转变为痴呆，严重影响患者工作和生活[2]。目前IS后认知功能障碍发病机制尚不明确，给疾病早期诊断带来一定困难，探讨IS后认知功能障碍相关分子机制有助于其预防、早期诊断和治疗。微小核糖核酸(microRNA，miR)在脑组织表达丰富，可调节转录后蛋白表达，在神经发生、重塑、突触形成方面发挥重要作用，可能在神经系统疾病中扮演至关重要的角色[3]。miR-132是大脑中主要的微小RNA，参与神经元可塑性、树突生长调控和学习记忆过程，其表达异常与神经退行性疾病有关[4]。miR-135是参与肿瘤细胞增殖、侵袭的类癌基因，近期研究发现miR-135参与靶基因与特定神经递质/神经调节信号转导、神经营养因子表达、突触形成，并可调节焦虑相关的行为[5]。现分析IS后认知功能障碍患者血清miR-132、miR-135表达与认知功能的关系，以及其预测认知功能障碍的价值，以期为临床诊治提供参考，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年2月—2020年3月西安医学院第二附属医院神经内科诊治IS患者147例，根据是否发生认知功能障碍将其分为障碍组(60例)和非障碍组(87例)。障碍组男35例，女25例，年龄61～75(68.25±3.26)岁；基础疾病：高血压35例，糖尿病40例，高脂血症29例；受教育年限9～13(9.25±2.26)年；病程2～7(5.01±1.35)个月；临床分期：恢复期41例，后遗症期19例；合并症：冠心病29例，心律失常12例，肺炎16例；既往治疗史：静脉溶栓21例，介入治疗17例，单纯药物治疗22例；有脑卒中遗传史13例。非障碍组男51例，女36例，年龄60～74(65.04±3.19)岁；基础疾病：高血压32例，糖尿病41例，高脂血症30例；受教育年限9～15(11.31±3.52)年；病程3～8(5.12±1.35)个月；临床分期：恢复期52例，后遗症期35例；合并症：冠心病31例，心律失常19例，肺炎23例；既往治疗史：静脉溶栓29例，介入治疗23例，单纯药物治疗35例；有脑卒中遗传史19例。2组性别、既往治疗史、临床分期及合并症比较差异无统计学意义(P>0.05)。障碍组年龄、合并高血压比例、合并糖尿病比例高于非障碍组(P<0.05)，受教育年限低于非障碍组(P<0.05)。本研究获得医院伦理委员会批准，患者家属均知情同意并签署同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①经头颅MR或CT诊断IS，符合“中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014”诊断标准[6]；②IS前无认知功能障碍；③初中以上文化程度。(2)排除标准：①颅脑外伤、颅内占位性病变、脑出血、脑血管畸形等患者；②生命体征不平稳者，合并恶性肿瘤，难以控制的慢性内科疾病严重并发症；③卒中后抑郁、失语、严重精神疾病等影响各种量表评定者；④其他原因引起的认知功能障碍。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-132、miR-135检测：2组均于入院次日晨采集空腹肘静脉血6 ml，注入不含抗凝剂的无菌试管，4 ℃、离心取血清分装于2支EP 管置于-80 ℃ 超低温冰箱(Thermo Fisher公司)保存。取1支样本加入TRIzol(美国Invitrogen公司)提取总RNA，ND-1000 紫外分光光度计(NanoDrop公司)检测RNA纯度和完整性。取总RNA 20 μg，采用M-MLV 逆转录酶(Epicentre 公司)将RNA逆转录为cDNA，反应体系20 μl;反应条件：15℃ 30 min、45℃ 30 min、85℃ 5 min 灭活。CFX96实时荧光PCR 仪(美国Bio-Rad)检测血清miR-132、miR-135表达；qRT-PCR流程：将cDNA样品分别加入qRT-PCR反应体系，反应液配制如下，PCR 0.4 μl引物F (10 μmol/L)、0.4 μl PCR 引物R (10 μmol/L)、PCR缓冲液1 μl(10×)、dNTP 1 μl(2.5 mmol/L)、氯化镁溶液0.6 μl、Taq聚合酶0.5 U、 ROX Reference Dye 0.2 μl、荧光染料Syber greenI 2.5 μmol/L，加水至8 μl。反应条件：95℃变性15 s， 65℃退火20 s; 75℃延伸15 s，共40个循环。引物购自金域医学检验中心，序列如下。miR-132上游:5'-GCCGATAACAGTCTACAGC-3',下游：5'-CAGTGCAGGG TCCGAGG-3'；miR-135上游:5'-ACAUAGGAAUAAAAA GCCAUATT-3',下游：5'-CUAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA-3'；U6上游：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游：5'CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。扩增反应结束后进行熔解曲线分析，共做3次平行试验。以U6 snRNA 为内参，2-ΔΔCt计算miR-132、miR-135相对表达量。

1.3.2 血清NSE、S-100β蛋白检测： 取另一支样本采用意大利BIOBASE2000型全自动酶免分析仪，以酶联免疫吸附试验检测血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S-100钙结合蛋白β(S-100β)水平，试剂盒购自上海贝西生物制剂公司，操作严格按其说明书进行。

1.3.3 认知功能评估： (1)应用中文版MoCA[7]评估患者认知功能，该量表共8个领域(视空间执行、命名、定向、记忆、注意力、抽象、延迟回忆、语言)，11个条目(视空间执行：交替连线、复制立方体、画钟；语言：复述、语言流畅性，其余各领域各1个条目)，满分30分，评分越低认知功能越低，<26分为异常。(2)应用简易智能精神状态检查量表(MMSE)[8]从定向、回忆、计算、语言、复述、执行功能与命名等7项评估，回答正确1分，错误或不知道0分，满分30分，评分越低认知功能越低，<26分为异常。根据MMSE评分将认知功能障碍患者60例分为轻度亚组19例(MMSE评分20～25分)、中度亚组27例(MMSE评分11～19分)、重度亚组14例(MMSE评分≤10分)[9]。

2 结 果

2.1 2组血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA评分比较 障碍组患者血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA评分均低于非障碍组(P<0.01)，见表1。

表1 2组患者血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA评分比较

2.2 认知功能障碍患者各亚组血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA评分比较 血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA评分比较，轻度亚组>中度亚组>重度亚组(P均<0.01)，见表2。

表2 障碍组各亚组患者血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA评分比较

2.3 血清miR-132、miR-135表达与血清NSE、S-100β水平、MoCA评分的相关性 Spearman秩相关分析显示，IS后认知障碍患者血清miR-132、miR-135表达均与血清NSE、S-100β水平、MoCA评分呈正相关(r=0.680、0.644、0.751，0.517、0.503、0.698，P均=0.000)。

2.4 血清miR-132、miR-135、miR-132+miR-135预测IS后认知功能障碍的价值 ROC曲线分析显示，miR-132、miR-135、miR-132+miR-135预测IS后认知功能障碍的曲线下面积(AUC)分别为0.667、0.657、0.902，miR-135、miR-132最佳截断值(cut-off)分别为0.72、0.69， miR-132+miR-135预测IS后认知功能障碍的AUC最大 (Z=2.956、3.052，P均<0.05)， 见表3、图1。

表3 血清miR-132、miR-135、联合miR-132+miR-135预测IS后认知功能障碍的效能

3 讨 论

脑卒中是导致认知功能障碍的主要原因，反复发作的脑卒中可增加认知功能障碍患病率和认知功能受损程度[10-11]，另外年龄、教育程度、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟与IS后认知功能障碍的发生也有密切关系。目前IS后认知功能障碍发病机制尚不清楚，炎性反应、免疫、氧化应激、谷氨酸兴奋毒性、Ca2+超载等均涉及IS后认知功能障碍的发病过程，而脑卒中引起海马、白质等关键部位病变是认知功能障碍发病的解剖学机制[12-13]。miRNAs在脑组织尤其是海马组织中表达较丰富，参与神经系统各类信号通路基因调控，具有调控神经细胞分化、增殖、凋亡作用，参与学习、记忆等过程[3]。miR-132定位于染色体17p13.3，在脑组织尤其是海马区高表达，具有调控多种蛋白表达，突触形态结构变化和功能作用，参与突触可塑性、学习、记忆等多种神经生理过程[14]。miR-132表达异常与阿尔茨海默病、精神分裂症、帕金森病等多种神经系统疾病有关[15-16]。认知功能障碍的发生与海马区神经元数量减少、形态异常均有关，推测miR-132可能参与IS后认知功能障碍的发生过程。本研究发现，血清miR-132表达与IS后认知功能障碍的发生和进展均有关，动物研究显示[17]，痴呆小鼠模型中miR-132表达下调。miR-132参与IS后认知功能障碍的作用机制为：(1)miR-132表达缺失可促使肌醇1,4,5-三磷酸三激酶B(ITPKB)上调，激活ERK1/2信号通路，增加重组人β分泌酶活性，促使β淀粉样蛋白(Aβ)产生沉积及Tau蛋白磷酸化，从而加速神经细胞凋亡坏死，最终导致认知功能受损，提示miR-132/ ITPKB通路可能参与认知功能障碍发生的病理过程[17]。(2)miR-132表达缺失可能上调神经退化相关蛋白质,如细胞周期蛋白依赖性激酶5、线粒体动力相关蛋白1等，并通过直接调控神经元一氧化氮合酶，促使一氧化氮产生，进而诱导Tau蛋白磷酸化参与认知功能障碍发病过程[18]。(3)miR-132可调控神经环路—突触可塑性，改善IS后痴呆大鼠行为学特征[2]，以上结果说明miR-132缺乏可能导致IS后认知功能的下降。

miR-135是非编码微小单链RNA，在人体内结合于靶基因miRNA 3' 端非翻译区，通过抑制Wnt信号通路APC基因表达促使细胞凋亡，抑制细胞增殖，参与胰腺癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤发病[19-22]。近期研究发现，miR-135可抑制突触核蛋白水平，发挥神经保护作用，miR-135是大脑对运动反应的第一个非编码RNA调控因子，对防止脑组织病理性老化有促进作用[23]。miR-135是轴突生长和皮质神经元迁移的有效刺激因子，miR-135受轴突生长和再生的内在抑制因子Kruppel样因子4(KLF4)调节，沉默KLF4可发挥miR-135神经保护作用，miR-135通过miR-135—KLF4通路参与神经调节过程。miR-135通过抑制KLF4促进成年小鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞轴突再生[24]。本结果提示，miR-135与IS后认知功能障碍的发生和进展均有关。但是miR-135在IS后认知功能障碍中的作用机制尚不清楚，目前相关报道并不多见，推测可能为：miR-135通过调控下游因子肌醇1，4，5-三磷酸腺苷受体1、肌醇聚磷酸酯-4-磷酸酯酶Ⅰ型的表达，增加小鼠齿状回神经前体细胞增殖，使神经发生增加[23]，因此miR-135表达缺失可能导致神经前体细胞凋亡，神经元功能破坏，进而引起认知功能障碍。 NSE、S-100β是脑损伤相关细胞因子，在神经元损伤后即从星形胶质细胞内释放进入脑脊液并经血脑屏障入血，能敏感反映脑损伤情况。MoCA是评估认知功能的常用量表，其评分随认知功能受损程度加重而降低。本研究相关性分析结果显示，miR-132、miR-135表达均与血清NSE、S-100β水平及MoCA评分呈正相关，表明IS后认知功能障碍的发生可能与神经受损有关，由于目前缺乏miR-132、miR-135与NSE、S-100β作用机制研究，其间关联机制尚不清楚。ROC曲线分析结果显示，miR-132、miR-135对IS后认知功能障碍的发生有一定预测价值，联合miR-132、miR-135可大大提高预测的准确性，提示miR-132、miR-135表达均降低时，IS患者认知功能受损程度更重，发生认知功能障碍的可能性越大，对临床诊断具有警示作用。

综上所述，血清miR-132、miR-135表达降低与IS后认知功能障碍发生、神经损伤程度均存在一定关系，可以为临床IS后认知功能受损程度评估提供一定参考。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘欣：提出研究方向、设计研究方案、起草论文；吉智：修订论文，论文终审；李毓新：实施研究过程、数据收集、分析整理；刘利宁、惠晶：进行文献调研与整理