不同浓度黄连素对乳腺癌T47D细胞生物学特性的影响

刘亚江， 冯金华，邹琼燕，黄文超，李佳艳

作者单位： 423000 湖南省郴州市第一人民医院医疗集团南院肿瘤ICU(刘亚江、黄文超、李佳艳)，健康管理中心(冯金华)；410011 长沙，中南大学湘雅二医院甲乳外科(邹琼燕)

乳腺癌是女性易患的恶性肿瘤之一，不同国家乳腺癌患病人数也不相同，我国乳腺癌患者年龄逐渐下降，比其他国家女性早10～15年[1]。中国属于发病率较低的国家，但是，近年来的增长速度却持续升高[2]。调查数据显示，我国东部城市的女性发病人数明显多于其他地区[3]。乳腺癌的病因相当复杂，该病的发生与遗传、环境等多种原因有关[4]，已引起临床及科研人员高度关注，正逐步加深治疗乳腺癌的相关研究。虽然手术治疗及术后的化、放疗发展迅速，对乳腺癌患者作用明显，但仍不能阻碍癌细胞的转移[5]。乳腺癌的转移、复发严重延缓了患者的康复时间，给治疗增加了很多困难。因此，寻求综合、有效的治疗方案是当今医学研究的热点[6]。黄连素是黄连抗菌的主要成分，该药物对临床常见疾病有一定治疗效果[7-8]。实验研究显示，黄连素对常见癌症存在一定抑制作用，但黄连素在乳腺癌中的作用及相关机制仍不清楚[9]。因此，现对乳腺癌细胞株(T47D细胞)凋亡、增殖、侵袭、迁移情况进行研究，并观察不同浓度黄连素对T47D细胞生物学特性的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)T47D细胞：在ATCC细胞库购买乳腺癌细胞株(T47D细胞)，随机分为3组，乳腺癌组(BC组)单纯T47D细胞不做其他处理，正常培养；低浓度组(LC组)将T47D细胞与10 μmol/L黄连素溶液混合培养；高浓度组(HC组)将T47D细胞与30 μmol/L黄连素溶液混合培养。(2)试药试剂：黄连素(上海曙灿实业公司)，胎牛血清CCK-8 试剂盒(北京杰辉博高生物公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)(绍兴市精源仪化贸易中心)。(3)仪器：恒温摇床(成都苏净器材公司，型号 CHA-S型)，离心机(上海继谱电子科技有限公司，型号 LGZ800)，荧光显微镜(上海万衡精密仪器有限公司，型号 XSP-BM22AY)，读板器(深圳玛雅电玩科技有限公司，型号 VL0000D0)，Transwell小室(武汉弗凡科技有限责任公司,型号PIHT12R48)，Guava流式细胞仪(南京兆坤仪器有限公司，型号Guava)。

1.2 细胞培养 2019年2—8月在郴州市第一人民医院进行实验。将T47D细胞在含有胎牛血清的DMEM培育液中培养。当细胞数量增长至80%～90%时，胰蛋白酶消化、离心、收集、重悬并培养T47D细胞。LC组、HC组分别将T47D细胞与10 μmol/L、30 μmol/L的黄连素溶液混合培养，48 h后用于检测实验。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 TUNEL检测T47D细胞凋亡：将盖玻片置于6孔板内，在6孔板中种入T47D细胞培养过夜，使T47D细胞生长占70%～80%培养皿，进行TUNEL染色，然后用20 μg/ml蛋白酶K孵育，用TdT/dUTP反应混合物在37℃孵育1 h进行DNA片段标记，然后使用PBS洗3次，用含有5%正常山羊血清的封闭缓冲液封闭1 h，将切片在封闭缓冲液中与兔抗大鼠SP1抗体(1∶1 000)一起孵育1 h，在避光、室温条件下孵二抗(1∶200)40 min，进一步冲洗后，用盖玻片覆盖切片，切片中加Vectashield Hard Set 封固涂片样本，标记反应，于荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

1.3.2 流式细胞仪检测T47D细胞凋亡：增加培养液调整T47D细胞密度为1.2×106/L，接种于6孔板中，处理12 h,培养箱中孵育24 h，采用不含EDTA的消化液消化，1 000 r/min离心5 min并收集细胞，4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，弃去上清液，各组分别加入400 μl预冷的1×结合缓冲液，分别加入5 μl Annexin V-FITC和LPI溶液，混匀细胞，避光孵育15 min后，1 h内上机检测。采用FC500流式细胞仪进行分析。

1.3.3 CCK-8法检测T47D细胞增殖： 取出转染后的T47D细胞，稀释为1×105/ml，置于细胞培养箱中孵育24 h后取出，取培养好的T47D细胞平铺到16孔板中培养。待细胞增长至一定数量后，加入CCK-8试剂10 μl。37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养4 h后，于全自动酶标仪(波长=450 nm)下检测各孔吸光度 A 值(A=各孔的OD值-调零孔的OD值 )。

1.3.4 细胞划痕法测定T47D细胞的迁移能力： 取一瓶长满的以对数生长的T47D细胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化并收集细胞，加入完全培养基终止消化后，将细胞悬液移至15 ml离心管中离心，速度1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，加入完全培养基5 ml，用1 ml移液枪充分吹打完全后，进行细胞计数，放入CO2培养箱中培养，第2天进行模拟罐法负压干预，在长满单层T47D细胞的情况下用细胞刮刀垂直培养袋底划痕(细胞刮刀的划痕宽度为0.5 mm)，用PBS洗细胞3次，洗去划下的细胞，加入无血清培养基并放入模拟罐法负压装置中，之后移至37 ℃、5%CO2培养箱培养、24 h后拍照(记为24 h)。

1.3.5 Transwell 检测T47D细胞侵袭： 取出转染后的T47D细胞，稀释为1×105/ml，在血清培养基中培养12 h。准备Transwell小室，上室铺ECM胶，下室加500 μl含10%血清培养基，静置4 h，吸出液体，残留液风干。取200 μl培养好的细胞接种在迁移室中,24 h后，取出细胞，乙醇固定，结晶紫溶液染色，显微镜下观察。

2 结 果

2.1 各组TUNEL法检测T47D细胞凋亡数量比较 镜下观察发现，BC组T47D细胞凋亡数量最少，HC组细胞凋亡数量最多，BC组细胞凋亡数低于LC组(t=7.111,P<0.01)，LC组凋亡数低于HC组(t=16.852，P<0.01)，3组细胞凋亡数量比较差异有统计学意义(F=336.254，P<0.01)，见图1。

2.2 各组流式细胞仪检测T47D细胞调亡率比较 HC组T47D细胞凋亡数量最多，凋亡率为(61.35±6.38)%，LC组为(26.97±3.75)%，BC组为(16.57±2.53)%。BC组细胞凋亡率低于LC组(t=7.275,P<0.01)，LC组凋亡率低于HC组(t=14.697，P<0.01)，3组细胞凋亡率差异有统计学意义(F=264.600，P<0.01)，见图2。

2.3 各组CCK-8法检测T47D细胞增殖比较 T47D细胞的增殖数量以OD值表示，HC组(0.45±0.06)低于LC组(0.72±0.08)(t=8.538，P<0.01)低于BC组(1.12±0.10)(t=9.877，P<0.01),3组细胞增殖数量比较差异有统计学意义(F=170.582，P<0.01)。

2.4 各组细胞划痕法检测T47D细胞迁移能力比较 0 h时3组T47D细胞均无迁移，24 h时HC组T47D细胞迁移面积最小为(358.4±37.5)pixel2，无细胞区域宽度最大；LC组T47D细胞迁移面积(474.9±46.8)pixel2显著高于HC组细胞(t=6.143，P<0.01)，BC组T47D细胞迁移面积(543.6±55.7)pixel2显著高于LC组细胞(t=2.986，P=0.007)，3组细胞迁移面积比较差异有统计学意义(F=39.25，P<0.01)，见图3。

2.5 各组Transwell法检测T47D细胞侵袭能力比较 HC组T47D细胞侵袭能力较差，显微镜下细胞侵袭数量为(11.22±0.84)个；LC组T47D细胞侵袭数量为(25.36±1.41)个；BC组T47D细胞侵袭数量为(46.75±3.18)个，HC组细胞侵袭数量少于LC组(t=27.246，P<0.01)，BC组细胞侵袭数量高于LC组(t=19.453,P<0.01)，3组细胞侵袭能力比较差异有统计学意义(F=754.263，P<0.01)，见图4。

3 讨 论

乳腺癌发病率已位居妇科癌症首位。近年来，我国在治疗乳腺癌方面获得了较多的成就，手术、化疗、内分泌及靶向治疗方式，在减轻患者痛苦的基础上，也提高了部分患者5～10年生存率，但癌细胞转移情况时有发生，发生率也同样居高不下[10]。随着临床工作者的不断探索，除常规手术之外的多种治疗手段也得到了应用，但早期乳腺癌的治疗方法仍局限于手术治疗，放疗加化疗的手术患者生存率也开始小幅度提升[11]，但治愈率仍较低，因此，急需寻找更好的药物来治疗乳腺癌。研究显示，黄连素具有氮三角的化学结构，在治疗临床常见疾病中有较显著的效果[12]。近年来发现，黄连素的药理作用在治疗癌症方面也较为显著，同时，黄连素具有高安全性、有效性和低成本的特点，可广泛应用于临床中癌症的治疗[13]。

研究发现，显著增加癌细胞中黄连素的含量能抑制卵巢癌细胞的生长。卵巢癌细胞的生长、发育与黄连素有密切关系，并在抑制癌细胞生长、迁移的过程中占主导地位[14-15]。本研究表明，BC组T47D细胞凋亡率最少，HC组T47D细胞凋亡率最多，HC组T47D细胞凋亡率显著多于LC组，LC组T47D细胞凋亡率显著多于BC组。HC组细胞增殖OD值显著低于LC组，LC组T47D细胞的增殖OD显著低于BC组。HC组T47D细胞侵袭、迁移数量显著低于LC组，LC组T47D细胞侵袭、迁移数量显著低于BC组。大量研究发现，黄连素在食管癌的发展过程中有抑制癌细胞的作用，其高表达还能抑制卵巢癌的增殖和转移能力。黄连素在治疗人体多种系统和器官恶性肿瘤中效果显著，高浓度黄连素可抑制食管癌细胞的生物学行为，发挥抑癌基因的作用[16-17]。研究表明，增加细胞中黄连素的含量能显著影响细胞的活性，与癌细胞的恶性度关系显著，能使其恶性度显著下降，这与宫颈癌的治疗率及复发率有显著关系，说明在宫颈癌的发展过程中，黄连素的用药浓度占关键作用[18]。报道显示，在卵巢癌细胞中黄连素高表达能减缓癌细胞的扩散、增殖，且黄连素浓度与抑癌作用呈显著相关性，即黄连素浓度越高，抑制作用越明显，凋亡细胞数量越多[19-20]。以上多种研究表明，黄连素能够抑制多种临床常见肿瘤，延长患者生存时间，提高患者生存质量，可以通过调节黄连素在癌细胞中的表达含量来达到治疗癌症的目的，为乳腺癌的诊断和治疗发展新方向。

综上所述，黄连素对T47D细胞的生长存在抑制作用，且与黄连素的浓度呈正相关，即浓度越高，抑制效果越明显。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘亚江、冯金华：提出选题及研究方向，设计研究方案，获取数据，实施研究过程，论文撰写；邹琼燕、黄文超：补充研究方向，分析研究数据，修改论文；李佳艳：进行统计学分析，补充数据，论文终审