超高效液相色谱

王睿 付志成 胡贻椿 毛德倩 杨晓光 陈竞 杨丽琛

摘 要：目的：建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定血清中维生素A、E的方法。方法：取标准系列工作溶液、空白替代血清样品（4% BSA牛血清白蛋白溶液）各50 μL，经硫酸锌、沉淀剂（甲醇/乙腈=50/50，V/V）沉淀蛋白，振荡，12 000 r/min离心5 min，取上清，低压离心挥干，复溶振荡，12 000 r/min离心5 min，取上清待测。采用Waters BEH Phenyl色谱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分离，以0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-甲醇溶液为流动相等度洗脱，电喷雾（ESI）正离子模式、多反应监测模式（MRM）下检测，内标法定量。结果：UPLC-MS/MS检测血清维生素A、α-维生素E、β-维生素E线性关系良好，相关系数分别为0.999 3、0.999 3、0.999 7;维生素A、α-维生素E、β-维生素E定量限分别为0.213、0.240、0.070 ng/mL，检出限分别为0.064、0.072、0.021 ng/mL;维生素A、E在低、高浓度加标回收率范围分别为89.7～107.4、97.6～118.1，RSD分别为2.45%～3.43%、1.48%～5.40%。结论：本研究建立的人血清维生素A、E超高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高、准确稳定、重现性好，对血清中维生素 A 和维生素 E 的测定具很好的的应用价值。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法;维生素A;维生素E;血清

准确评价人体维生素A、E的营养状况对于相关疾病的及早预防与治疗非常重要[1-3]。文献报道，检测食品中维生素A、E的方法主要有分光光度法、荧光分析法、高效液相色谱法、双波电压法、示波极谱法[4-6]等，国家也分别在2003年、2010年和2016年对食品中维生素A、E的测定出台及修订了相关国家标准[7-9]，推荐方法为反相色谱法。人体血液中维生素A、E以多种形式存在，维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，其中α-生育酚分布最广、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最强。目前，血清中维生素A、E的测定方法主要有高效液相色譜法、质谱法、酶免疫测定法等[10-13]。人群血清维生素A筛查方法已经建立标准（WS/T 553—2017）[14]。如HIX J[10]等用酶免疫测定视黄醇结合蛋白，但该方法特异性和灵敏度较差，只能测定视黄醇结合蛋白而非视黄醇;高效液相色谱法在同时测定维生素A和维生素E时出峰时间长，分离维生素E的四种异构体时分离度欠佳，对色谱柱及柱温有较高要求，且样本量需求较大，一些小的实验室或大批量人群检测很难满足以上条件[11]。贾妍等[12]建立了液相色谱串联质谱法检测方法，但该方法仅实现了维生素A和维生素E的定量分析，未完成维生素E四种异构体的定量分析。

本研究目的基于超高效液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS法），建立一种分离度好、分离时间短、用血量少的可推广的血清维生素A、E同时检测方法，可以准确快速测定维生素A和维生素E异构体含量。

1 材料与方法

1.1 仪器

ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪、XEVO TQ-S 串联四级杆质谱仪、Masslynx质谱软件，均来自美国Waters科技有限公司;电子分析天平（感量0.1mg）;涡旋仪;低速冷冻离心机 KDC-2046，科大创新公司;旋转真空干燥仪，吉艾姆公司;Milipore纯水仪，美国密理博公司;微量移液器，德国Eppendorf公司。

1.2 试剂

Retinol-D5同位素标记物（Santa Cruz Biotech公司）：纯度>98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;Alpha-Tocopherol-D6同位素标记物（Sigma-Aldrich公司）：纯度>98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;维生素A标准品（Retinol）和维生素E标准品（α-Tocopherol、β-Tocopherol、γ-Tocopherol ），均购自Sigma-Aldrich公司;LC/MS级甲醇、LC/MS级甲酸、色谱级乙醇、正己烷、乙腈，均购自Merck公司;牛血清白蛋白（BSA）：纯度≥99%;七水合硫酸锌：纯度≥99%;超纯水：Milipore纯水仪制备。

1.3 试剂配制

沉淀剂：甲醇∶ 乙腈（1∶ 1，v/v）;甲酸-水溶液：0.1%;甲酸-甲醇溶液：0.1%;0.07%BHT甲醇溶液（m/v）;BSA溶液：称取1.6 g BSA溶解至40 mL水中;Retinol标准储备溶液（0.5 mg/mL）;α-Tocopherol标准储备溶液（5 mg/mL）;β-Tocopherol标准储备溶液（0.5mg/mL）。

1.4 溶液配制

1.4.1 标准溶液配制 取Retinol标准储备溶液、α-Tocopherol标准储备溶液、β-Tocopherol标准储备溶液各100 μL，50% 甲醇-水溶液700 μL配制成混合标准品溶液。工作标准液是将混合标准品溶液逐级稀释，均用棕色瓶储存。

1.4.2 内标工作液 Retinol-d5同位素内标标准储备溶液（1 μg/mL）;α-Tocopherol-d6同位素内标标准储备溶液（1 μg/mL）;混合同位素内标溶液：1 μg/mL，用50%甲醇-水溶液配制。

1.5 样品前处理

取标准系列工作溶液各50 μL，在标准系列工作溶液中分别加入混合同位素内标溶液20 μL、空白替代血清样品（4% BSA牛血清白蛋白溶液）50 μL 、4.5%硫酸锌水溶液10 μL、200 μL沉淀剂（甲醇/乙腈=50/50，V/V），室温下涡旋振荡混匀60 s;加入1 mL正己烷，室温下涡旋振荡5 min，然后在4 ℃ 12 000 r/min下离心5 min;吸取0.8 mL上清液至1.5 mL离心管中，低压离心挥干溶剂;用500 μL初始流动相（0.1%甲酸，96%甲醇水溶液）复溶，涡旋振荡30 s，继续4 ℃ 12 000 r/min下离心5 min，上清液转移至进样瓶中待UPLC-MS/MS分析。1.6 仪器条件

1.6.1 色谱条件 采用Waters BEH Phenyl色谱柱（柱长100 mm、柱内径2.1 mm、填料粒径1.7 μm），以0.1%甲酸-水溶液为流动相A、0.1%甲酸-甲醇溶液为流动相B，按照体积比进行等度洗脱，A相∶ B相=4∶ 96，流速0.3 mL/min，柱温20 ℃，进样量2.0 μL。

1.6.2 质谱条件 采用多反应监测模式（MRM）、电喷雾（ESI）正离子模式，喷雾电压4 000 V，离子源温度400 ℃，气帘气152 psi，雾化器气流7.0 Bar，去溶剂气1 000L/Hr（表1、附图）。

1.7 标准曲线绘制

取混合标准品溶液用甲醇-水溶液（1∶ 1，v/v）逐级稀释（表2），分别加入20 μL混合同位素内标溶液、50 μLBSA溶液、10 μL硫酸锌溶液、沉淀剂200 μL。由于方法前处理过程较为复杂，为对样品处理过程中进行质量控制，在样品处理前加入同位素内标，以校正待测物质在前处理或仪器进样检测出现偏差。综合考虑化合物性质及内标物质的可获得性，采用性质相似的同类物质作为对应内标，维生素A对应内标物质为Retinol-d5，维生素E对应内标物质为α-Tocopherol-d6。液相色谱和串联质谱分析条件下，将标准系列工作溶液由低浓度到高浓度进行进样分析，以维生素A、α-维生素E、β-维生素E的色谱峰与其对应的同位素内标色谱峰的峰面积比值-浓度比值作图，得到标准系列工作溶液的直线拟合方程，计算其线性相关系数。

2 结果与分析

2.1 液相条件优化

本研究对比了Waters ACQUITY HSS PFP色谱柱、Waters Symmetry C18色谱柱和Waters BEH Phenyl色谱柱，后者获得了更好地分离效果和比较对称的峰形，特别是对于维生素E的各种化合物的分离效果很好，也解决了之前其他色谱柱拖尾现象。本研究分别选择了0.1 %甲酸-水溶液与0.1%甲酸-甲醇溶液分别为95∶ 5、96∶ 4、97∶ 3的比例作为流动相，也对比了不同柱温（20.30、35℃）、流速（0.2、0.3、0.5 mL/min）和進样量（1.0、2.0 μL）对加有内标的维生素A、E标准品进行色谱分析，最终选择峰形最好、保留时间最短的作为此次研究的最终理想色谱条件。

2.2 质谱条件优化

本研究采用多反应监测模式（MRM）、电喷雾（ESI）正离子模式，采用自动调谐优化和手动调谐优化相结合的方式，优化DP、CE、EP和CXP，选定对质谱响应最强的两个离子对分别作为定量离子对和定性离子对。

2.3 前处理条件优化

本研究采用两步沉淀蛋白，先使用ZnSO4溶液进行释放蛋白结合物，然后加入1∶ 1甲醇/乙腈溶液进行沉淀蛋白，结果发现，色谱图中噪音明显减少，从而减少杂质对目标峰的影响。

2.4 方法线性范围、检出限和定量限

取混合标准品溶液用甲醇-水溶液（1∶ 1，v/v）逐级稀释（表2）。以色谱峰信噪比S/N=3时对应的浓度作为方法的检出限，以色谱峰信噪比S/N=10时对应的浓度作为方法的定量限（表3）。

2.5 方法准确度和精密度

取混合血清做本底，加入两个水平的标准液，每个浓度水平重复6份平行样，低压离心挥干后，上机测定，计算其精密度和加标回收率（表4）。

3 讨论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中维生素A、E的方法，该方法对前处理的步骤进行了优化，使血清中蛋白沉淀的更加彻底，使色谱图中噪音明显减少，从而减少杂质对目标峰的影响，确保了在大批量进样后色谱图噪音保存不变。本研究对色谱柱种类进行了考察，最后选择BEH Phenyl色谱柱，其能最大限度去除杂质分子，拥有更好的分离度和更窄的峰型，使分析物与共流出物更好的分离，以类似物为内标，消除了基质效应的影响。另外，本研究方法相较其他方法前处理需要的样本量更少，最少取样量可至20 μL，且维生素A、β-维生素E、α-维生素E保留时间分别为1.29、1.79、1.89 min，3 min可完成1个样本分析，操作安全简单，检测高效快速，尤其适合大批量现场或临床工作的要求。本研究结果显示，所测维生素A、E的低、高浓度加标回收率范围分别为89.7～107.4、97.6～118.1，RSD分别为2.45%～3.43%、1.48%～5.40%，具有较好的准确度和精密度。总之，本方法前处理简便安全，测定灵敏、准确、重现性好，具有线性范围宽，检出限和定量限低的优点，适用于微量血清中维生素 A 和维生素 E 的定量分析研究。◇

参考文献

[1]陶懂谊，马文领.维生素A的生物学作用及其缺乏的防治[J].中国医药导报，2013，10（1）：25-26、29.

[2]王睿，陈竞，杨丽琛，等.2010—2012 年我国城市育龄妇女维生素A 营养状况分析[J].营养学报，2016，38（6）：537-540、545.

[3]刘信嘉，林森煜，李秀英，等.正相高效液相色谱法同时测定奶粉中维生素 A 醋酸酯、维生素 A 棕榈酸酯、维生素 E 醋酸酯及 α-生育酚[J].广东化工，2015，42（5）：126-127.

[4]Turner C，Mathiasson L.Determination of vitamins A and E in milk powder using supercritical fluid extraction for sample clean-up[J]. Journal of Chromatography A，2000，874（2）：275-283.

[5]Devries J W，Slivera K R，Mcsherry E，et a1.Determination of vitamin A（retinol）in infant formula and adult nutritionals by liquid chromatography：First action 2011.15[J]. Journal of AOAC International，2012，95（2）：322-328.

[6]趙海燕，赵榕，杨永红，等.冷皂化-HPLC 测定强化食品中的维生素 A、E 的方法研究[J].中国食品卫生杂志，2010，22（4）：344-347.

[7]中华人民共和国卫生部.GB/ T 5009.82—2003 食品中维生素 A和维生素 E 的测定[S].北京：中国标准出版社，2003.

[8]中华人民共和国卫生部.GB 5413.9—2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 A、D、E的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[9]中华人民共和国卫生部.GB 5009.82—2016 食品安全国家标准食品中维生素 A、D、E的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

[10]Hix J，Rasca P，Morgan J，et al.Validation of a rapid enzyme immunoassay for the quanfltalion of retinal—binding protein to asSCseS vitamin A status within populations[J].Eur J Clin Nutr，2006，60（11）：1299-1303.

[11]Hart G R，Furniss J L，Laufie D，et al.Measurement of vitamin D status：background，clinical use，and methodologies[J].Clin Lab，2006，52（7-8）：335-343.

[12]贾妍，战思恩，翟燕红，等.液相色谱串联质谱法测定血清维生素 A、E 含量[J].标记免疫分析与临床，2018，25（4）：574-579.

[13]张小敏，王洁，王淑静，等.DLPME-HPLC 法同时测定人血清中维生素 A 和维生素 E 含量[J].医学信息，2019，32（20）：161-163.

[14]中华人民共和国国家卫生健康委员会.WS/T 553—2017人群维生素A缺乏筛查方法[S].北京：中国标准出版社，2017.

Abstract：Objective   To establish a method for simultaneous determination of serum vitamin A and E by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）method.Method   Take 50 μL each of standard series working solution and blank replacement serum sample （4% BSA），after proteins were precipitated by zinc sulfate and precipitant （methanol / acetonitrile = 50/50，V/V），take the supernatant for testing after pre-processing，and then separated by Waters BEH Phenyl （2.1mm×100 mm，1.7 μm）and eluted with the mobile phaes consisted of 0.1% formic acid in water and methanol in a equals program，then analyzed by UPLC-MS/MS with the positive electrospray ionization（ESI+）mode and multiple reaction monitor（MRM）mode，internal standard method for quantification.Result   UPLC-MS / MS detection of serum vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E had a good linear relationship，the correlation coefficients were 0.999 3，0.999 3 and 0.999 7，respectively.The quantitation limits of vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E were 0.213 ng/mL，0.240 ng/mL and 0.070 ng/mL，respectively，the detection limits of vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E were 0.064 ng/mL，0.072 ng/mL and 0.021 ng/mL.Low and high concentration of vitamin A and vitamin E recovery rate were 89.7～107.4 and 97.6～118.1 respectively，RSD were 45%～3.43% and 1.48%～5.40% .Conclusion   This proposed method is sensitive，accurate and stable，reproducible，and has very good application value for the determination of vitamin A and vitamin E in serum.

Keywords：UPLC-MS/MS;vitamin A;vitamin E;serum