基于细胞代谢活性的抗菌材料抗菌性能快速检测研究进展

吕想 满东楠 林如梦 唐乔 刘鹏鹏

摘 要：抗菌性能检测是衡量抗菌材料性能的关键指标。传统的抗菌检测方法步骤繁琐，检测周期长，对检测人员和环境的要求较为严格，与现代抗菌检测发展要求较不相匹配。而抗菌性能的快速检测可缩短检测周期、提高材料利用率、降低废弃物处理难度，因此建立一种简单高效的抗菌性能快速检测方法成为抗菌行业发展的迫切任务。本项目拟建立一种将2，3，5-三苯基氮化四氮唑（TTC）应用于快速检测，以细菌代谢活性为基础具有高效准确的特点的抗菌材料抗菌性能的快速检测方法。

关键词：抗菌活性;抗菌性能快速检测;2，3，5-三苯基氮化四氮唑

抗菌材料是指以抗菌剂作为有效抗菌成分的材料[1]。抗菌材料中的抗菌剂成分具有能够抑制微生物生长繁殖甚至杀灭微生物的功能，用这些抗菌材料制成的各种制品可减少细菌交叉感染的机会，从而达到长期卫生、安全的目的。近年来，随着抗菌材料在医疗用品、生活用品、食品包装材料和建筑材料等领域的广泛应用，抗菌材料的开发和应用已逐渐成为研究的热点。在抗菌材料研制开发过程中不可避免的要用到抗菌性能检测的方法，目前抗菌性能检测方法均需采用培养基对细菌培养，通过平板计数测算抗菌活性，具有检测周期长（一般3至5天），操作复杂等缺点，且对操作环境和人员技术能力要求较高。建立一种简单快速准确的材料抗菌性能检测方法已迫在眉睫。2，3，5-三苯基氮化四氮唑（2，3，5-triphenyltetramLiumchloride，缩写为TTC），细菌代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将其还原，其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲臢（TTF）。TTC溶于水中成无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲臢（TTF），TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化。嗜中温性需氧菌在其新陈代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可以使无色的TTC还原为红色的TTF的特性，故可以将TTC作为细菌生长的指示剂[2-3]。而将该原理应用于抗菌材料抗菌性能的研究尚未见研究报道。

1 抗菌材料抗菌性能快速检测研究进展

1.1 现有方法

目前抗菌材料抗菌性能检测的方法主要有振荡法、吸收法、贴膜法及琼脂扩散法等，根据检测对象的不同可主要分为抗细菌能力检测和抗真菌能力检测两大类。

1.1.1 抗细菌能力的测定方法及对比

抗细菌能力检测方法分为三大类，分别是贴膜培养法和浸渍法、接触法或包埋法及振荡法。贴膜培养法和浸渍法

需要菌液与样品接触培养较长时间，培养过程中需要控制的条件较多，包括细菌活性、细菌所需营养、湿度、温度等条件，有可严格定量的优点。接触法或包埋法采用使样品直接接触混有菌液的培养基或包埋其内的方法，进行不同时间的培养后，观察细菌在样品及其周围的生长情况和样品受侵蚀情况，存在周期长和不便作为产品质量控制的定量评价的缺点。振荡法是将样品浸泡在一定浓度的菌液中，对其不断进行振荡培养，定时采用活菌计数法计算抗菌率，适用于织物、泡沫塑料、一次性卫生用品等的测定。

1.1.2 抗真菌能力的测定方法

抗真菌能力检测方法分为两大类，分别是接触法和暴露法。接触法与检测抗细菌能力的方法一致，將样品贴于培养基上，在样品及培养基表面均匀地喷洒一定量的混合孢子悬液，培养一定时间，定期观察，观察菌生长情况分等级评价抗菌材料的抗霉菌性。暴露法是将样品暴露于霉菌生长的场所后测定样品的长霉程度，有操作不便和污染环境的缺点。

1.2 优缺点及适用范围

上述各种检测方法都对操作人员的操作要求较为严格并且都需要一定的培养时间，检测周期比较长，为抗菌检测带来诸多不便。所以设计一种新的快速检测方法成为抗菌制品发展的需要。

2 TTC显色检测原理及现有应用

2.1 检测原理

TTC显色检测法即是基于TTC这一种氧化还原染料与活细胞内的脱氢酶反应，被还原为红色的TTF，其基本原理是活细胞中的呼吸酶的活跃情况能较正确地表现细胞活性的强弱，同时氧化还原染料会再呼吸酶的作用下使细胞着色，所以可以根据着色情况来判断细胞的活力[4]。

2.2 现有应用

TTC法的优点是可以应用于许多活细胞上且测定结果都比较精确，但存在有无活性的界限不明确，容易出现测量值偏高，上色所需时间较长，容易褪色等缺点。目前，TTC法主要用于农业科学方面，常用于：

2.2.1 花粉生活力测定

其基本原理是花粉中呼吸酶的活跃情况能较正确地反映其生活力的强弱，同时氧化还原染料能在呼吸酶的作用下着色，因此可根据着色情况来判断花粉的生活力。具体操作过程为：第一步，取少数花粉置于载玻片上，加1-2滴TTC溶液，盖上盖玻片。第二步，将制片放置35℃恒温箱中15min，然后在低倍镜下观察。凡是染成红色的花粉，其生活力为强，淡红的次之，无色的为不具活力的花粉或不育花粉。第三步，观察2-3个制片，每片取5个视野，统计100粒，然后计算花粉的活力百分率[5]。

2.2.2 植物根系活力测定

显色。取根和侧根，每重复分别均称取一定重量（约0.5g）样品，依次加人0.4%TTC溶液和（1/15）mol/L磷酸缓冲液各5mL，充分混合，并使根尖切段完全浸入上述反应液中，于37℃的恒温箱内以黑暗条件培养2h，以使根尖切断显色[6]。

2.2.3 植物种子活力测定

配制0.05%、0.10%、0.50%TTC溶液，避光保存，溶液一旦变成红色不能再用。样品处理与红墨水染色法相同。每个培养皿中分别加入0.05%、0.10%、0.50%TTC溶液，然后将其放在30℃左右的恒温箱中1.5h左右，随后将TTC溶液倒掉，并用水反复冲洗几次，观察染色情况。胚部呈红色的则具有生活力，呈浅红色的具有较弱的生活力，无色的便是无活力种子。但发芽试验发现呈浅红色的一般也可发芽，所以呈浅红色的也算具有发芽能力[7]。

2.2.4 各种活细胞的活力测定

将在一定的培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂，TTC会显不同的颜色，产酒精能力强的酵母会显现深红色，次之显粉红色，微红色的或不显色的为野生酵母。使用TTC平板法筛选西瓜酒酵母可以筛选出产酒精[8]。

3 TTC显色方法建立

3.1 材料

M-H琼脂培养基、M-H肉汤培养基、TTC、琥珀酸钠、质控菌株，供试菌株、药敏试纸。

3.2 试验方法

3.2.1 TTC显色培养基指示剂适宜浓度的确定

3.2.1.1 制备试验菌液

取质控菌株新鲜斜面，挑取1块接种环菌苔移至9mL肉汤培养基，置35℃下培养4-6h，制成新鲜菌液，将新鲜菌液用0.9%氯化钠灭菌溶液倍比稀释成含菌量为50-150CFU/mL的供试菌液。

3.2.1.2 1%TTC储备液的制备

取1gTTC、2g琥珀酸钠溶于100mL生理盐水，121℃灭菌锅处理15min备用。

3.2.1.3 含TTC梯度质量分数培养基的制备

配制M-H琼脂培养基，121℃高压灭菌15min。分别取

0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL质量分数1%的TTC储备液加入到100mL经高压灭菌冷却至50-60℃的M-H琼脂培养基内摇匀，配成6级含TTC系列质量分数的培养基。

3.2.1.4 TTC系列质量分数培养基对大肠杆菌菌落的显色反应及抑菌性试验

按《中国药典》附录微生物限度检查法中菌落计数的方法，将含菌量为50-150CFU/mL的供试菌液1mL加入灭菌平皿中，用含不同TTC质量分数的M-H琼脂培养基15mL浇碟（每质量分数为1组，每组6个平皿），同时以不加TTC的M-H琼脂培养基15mL浇碟（6个平皿）作为对照组。35℃培养箱中培养16-18h，观察各试验组和对照组的菌落颜色并进行菌落计数，计算平均菌落数。

3.2.2 TTC显色快速药敏试验

为了获取供试菌株TTC显色快速药敏试验所需时间和敏感度方面的数据，本试验将参考药敏纸片试验的结果及药物分类代表，选取多种兽医临床常用药物的药敏纸片进行药敏试验。①制备试验菌液：取供试菌株制备0.5个麦氏单位浊度的细菌悬液;②制备TTC显色培养基：配制M-H琼脂培养基，高压灭菌后冷却至50-60℃，按1000mL加3mL的比例加入1%TTC储备液，配成含0.003%TTC的显色培养基，倒入无菌培养皿;③接种平板：用1个无菌棉拭子蘸取菌液，并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液。用拭子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60°，保证涂布均匀。盖上平皿，室温下放置3-5min，使培养基表面的水分蒸发，然后贴药敏纸片;④贴药敏纸片：用无菌镊子将药敏纸片贴于平皿上，每个平皿贴6种药敏纸片。纸片要贴得均匀，纸片与纸片中心距离不小于24mm，紙片中心距平板边缘不小于15mm。贴上纸片15min内，把平皿倒放在35℃培养箱中培养16-18h;⑤孵育：TTC显色半固体琼脂置37℃孵育2、3、4、5、10、15、18h，取出测量抑菌环直径;⑥结果判读：按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）制定的标准进行判读，以敏感（S）、中介（I）和耐药（R）的形式解释结果;⑦质量控制：每次试验用质控菌对所有鉴定用试剂及药敏分析用抗生素纸片进行质量控制，以符合预期结果和NCCLS的药敏质控标准。

4 展望

近年来，抗菌材料的使用更加广泛，抗菌材料的开发和应用已逐渐成为研究的热点，在抗菌材料研制开发过程中不可避免的要用到抗菌性能检测的方法，本项目以抗菌材料为研究对象，根据细菌代谢过程产生琥珀酸脱氢酶还原TTC显色的原理，通过抗菌材料与细菌的接触培养、TTC显色剂显色反应、显色程度或变色时间、TTC还原产物TTF的浓度测定等多方面的研究，拟建立一种准确、有效的基于细菌代谢活性的抗菌材料抗菌性能快速定性、定量检测方法。快速检测方法可以用于抗菌产品的生产在线抽检，随着生产检测控制产品质量，也可以用于抗菌性能演示和消费者自行检测，确保让消费者自己了解所售产品的抗菌性能，促进抗菌行业健康快速的发展。

参考文献：

[1]麻晓霞，裴阳阳，雷云，等.负载型无机抗菌材料的研究进展[J].功能材料，2017，48（009）.

[2]刘慧.现代食品微生物学[M].北京：中国轻工业出版社，2006：325-336.

[3]白士茂.氯化三苯基四氮唑对细菌生长指示的适用性研究[J].浙江实用医学，1997，000（002）：12-13.

[4]王钦丽，卢龙斗，吴小琴，陈祖铿，林金星.花粉的保存及其生活力测定[J].植物学通报，2002（03）.

[5]胡适宜.植物胚胎学实验方法（一）：花粉生活力的测定[J].植物学通报，1993（02）：60-62.

[6]郑坚，陈秋夏，金川，等.不同TTC法测定枫香等阔叶树容器苗根系活力探讨[J].浙江农业科学，2008（01）.

[7]张薇，耿雷跃，杨雅华，张启星.水稻种子活力的快速测定方法[J].现代农业科技，2015（08）.

[8]胡晓冰，王振伟.TTC法在筛选西瓜果酒酵母中的应用[J].酿酒科技，2011（02）.

基金项目：

国家级大学生创新创业项目（项目编号：201910356020），

浙江省质量技术基础建设项目（项目编号：20180116）。