肉种鸡场鸡毒支原体感染的治疗效果评价

（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticam，MG）感染主要引起鸡的呼吸道症状，又称鸡慢性呼吸道病（CRD），表现为气管、肺和气囊的呼吸道炎症[1-2]。种母鸡感染后，病原可以通过血液从呼吸道传播到输卵管，导致产蛋量和孵化率降低，种蛋品质下降。MG 可在鸡群中长期存在和蔓延，并可通过种蛋传播给下一代[3-5]。该病流行于全世界鸡场中，给家禽业造成巨大经济损失[6]。

已普遍存在MG 流行的国家，很难通过净化根除本病[7]。目前国内控制MG 感染的主要措施是药物防治和疫苗接种。抗菌药物已被证明可以控制支原体的经卵传播，减少临床症状和病变的出现[8]。用于防治MG 的药物主要有喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和截短侧耳素类[8-9]。临床治疗时，通过耐药性检测来选择敏感药物防治，可最大限度地提高药物的治疗效果和降低耐药性产生。

目前关于抗菌药物对MG 治疗效果评价方法的报道，主要是对MG 引起的雏鸡呼吸道症状的治疗效果评价，而对种鸡感染MG 引起的产蛋和孵化率下降的治疗效果评价却很少。PCR 检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速等优点，适合MG 的感染率调查。但由于鸡胚样品中MG 含量极低，普通PCR 往往检不出来，而套式PCR 检测支原体具有更高的特异性[10]。

山东省某大型AA 父母代肉种鸡场饲养的肉鸡，在大约44 周龄时，出现产蛋率和孵化率降低以及雏鸡1 周内出现较高比例的呼吸道症状，至46 周龄时，该情况仍无明显改善，后经实验室检测确诊为MG 感染，并分离鉴定出1 株MG，命名为ZBMG01[11]。该种鸡场的MG 控制方案为产蛋期每隔1～1.5 个月，用泰妙菌素饮水净化1 次。

本研究选择套式PCR 检测种蛋或孵化后期死胚的MG 感染率，来评定种鸡的药物治疗效果，以期为种鸡场MG 感染和防控效果评价模式的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

MG 培养用支原体培养基，参照现行《中国兽药典》（三部）上规定方法进行改良配制而成；2×TaqMaster Mix，购自Biomiga 公司；基因组DNA 提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；鸡毒支原体S6 株，购自中国兽医药品监察所；7～9日龄SPF 鸡胚，购自济南斯帕法斯家禽有限公司；抗菌药物配制，参照文献[11]方法；10%恩诺沙星和45%泰妙菌素，由拜耳（中国）有限公司提供。

1.2 最低抑菌浓度（MIC）测定

支原体MIC 测定方法参照文献[12-13]。将MG 分离株ZBMG01 传至3～5 代的对数生长期的培养物，用培养基稀释至104CFU/mL，作为检测用菌液。抗菌药物于96 孔细胞培养板上，使用支原体培养基进行2 倍连续稀释，使质量浓度为7.875×10-3～8.000×101μg/mL。于每个孔倍比稀释的抗菌药液中，加入同等剂量稀释至104CFU/mL的菌液。同时，设生长对照孔（不加抗菌药物的接种物）、终点对照（pH6.8 的空白培养基）和无菌对照（pH7.8 的无菌培养基）。将平板在37 ℃ 5%CO2的湿润二氧化碳培养箱中培养，直至生长组和终点对照具有相同的颜色。将引起无颜色变化的最小药物浓度定义为MIC。

1.3 药物对比治疗

该种鸡场发病后6 周内，病情无缓和。根据MIC 测定结果，选用10%恩诺沙星和45%泰妙菌素进行对比治疗。将同一饮水系统下的鸡群作为1个单位，分为3 组：恩诺沙星治疗组，10 mg/kg（体质量）饮水，连用5 d；泰妙菌素治疗组，25 mg/kg（体质量）饮水，连用5 d；对照组，未用药物治疗。各组取5 d 后的未上孵种蛋以及上孵后孵化后期死胚各30 枚送实验室检测。药物对比治疗后，调查种蛋孵化率。

1.4 套式PCR 检测

1.4.1 基因组DNA 提取

1.4.1.1 鸡胚中细菌基因组DNA 提取 使用试剂盒提取。无菌采集送检鸡胚和10 枚7～9日龄SPF 胚的2～4 g 卵黄囊（附带少量卵黄），加入到3 mL PBS 中，于4 ℃浸泡12～24 h；摇匀后，取1.5 mL 浸泡液匀浆，12 000 r/min 离心10 min，弃上清液；将沉淀采用DNA 提取试剂盒提取DNA。

1.4.1.2 MG 菌株DNA 提取 MG 分离株ZBMG01和标准株S6 的模板DNA，采用水煮法提取，具体提取方法参考文献[14]。

1.4.2 引物设计与合成 参考文献[15]，利用DNAstar 软件，对GenBank 中的MGmgc2基因序列进行同源性分析，然后根据MG S6 株（登录号CP006916.2）基因保守区域，合成2 对引物（表1）。

表1 引物信息

1.4.3 套式PCR 反应条件 外套引物扩增反应体系为25.0 μL，其组分为：2×TaqMaster Mix 10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，模板1.0 μL，加水补齐至25.0 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32 个循环，最后72 ℃延伸10 min。内套引物扩增反应体系为25.0 μL，其组分为：2×TaqMaster Mix 10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，模板（外套PCR 扩增产物1.0 μL）1.0 μL，加水补齐至25.0 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32 个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.4.4 套式PCR 电泳及序列测定 反应结束后，取5 μL PCR 产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。将ZBMG01 株和标准株S6 内套引物PCR扩增产物，经胶回收纯化后送大连宝生物公司测序，对测序结果利用NCBI 网站的BLAST 软件进行比对。

2 结果

2.1 最低抑菌浓度（MIC）测定

MIC 结果见表2。MIC ≤5 μg/mL 的药物从低到高分别是四环素类中的沃尼妙林（双萜烯类）、强力霉素（四环素类）、泰妙菌素（双萜烯类）、恩诺沙星（氟奎诺酮类）、大观霉素（氨基糖苷类）、泰乐菌素（大环内酯类）和氟苯尼考（氯霉素类）。MIC ≥20 μg/mL 的药物从高到低分别是替米考星（大环内酯类）、阿奇霉素（大环内酯类）、丁胺卡那霉素（氨基糖苷类）和林可霉素（林可酰胺类）。

2.2 套式PCR 检测

2.2.1 套式PCR 电泳及序列测定 MG ZBMG01株和S6 株经外套引物扩增，获得预期大小为738 bp的片段；以外套引物扩增产物为模板进行内套引物PCR 扩增，获得预期大小为212 bp 片段（图2）。产物经胶回收纯化后测序，测序结果于NCBI 网站利用BLAST 软件进行比对，发现与GenBank 登录的MG S6 株（登录号CP006916.3）同源性为100%。对从10 枚7～9日龄SPF 胚卵黄囊（附带少量卵黄）中提取的基因组DNA 进行PCR 扩增，结果未扩增出相应的条带（图3）。对送检的鸡胚进行检测，结果部分鸡胚扩增出相应的条带（图4）。

表2 12 种抗菌剂对抗MG 分离株ZBMG01 的MIC 单位：μg/mL

图2 MG ZBMG01 株和S6 株内套引物扩增结果

图3 SPF 胚卵黄囊样品内套引物检测结果

图4 部分样品内套引物检测结果

2.2.2 套式PCR 检测 该养殖场于发病后6 周，选用恩诺沙星和泰妙菌素进行对比性治疗，1 个疗程（5 d）后，随机抽取3 组种蛋和种蛋孵化后期死胚进行套式PCR 检测。结果（表3）显示，经泰妙菌素和恩诺沙星治疗1 个疗程后，并未完全清除种蛋的MG 感染，但与未治疗的对照组相比，感染率明显下降（P=0.006，＜0.01），表明两种药物均可有效控制MG 经种蛋传播。对比两种药物治疗后未上孵种蛋和孵化后期死胚的内套引物扩增结果，发现感染率差异不显著（P=0.391，＞0.05），表明两种药物治疗效果相近。

3 讨论

支原体体外耐药性检测主要是进行MIC测定。但由于支原体生长条件苛刻、现有培养方法不尽相同等原因，目前国际上还无根据MIC 检测结果判定MG 耐药性的统一标准。Nhung 等[15]根据已发表文献总结出几种防治支原体抗菌药物的MIC50值和四分位距（interquartile range，IQR），如恩诺沙星（1.48 μg/mL，IQR 0.26～11.31），泰乐菌素（0.125 μg/mL，IQR 0.015～0.330）和强力霉素（0.062 μg/mL，IQR 0.015～0.200）等。本研究将ZBMG01 株测定的MIC 与文献[10，15]公布的禽支原体对常用抗菌药物的MIC50进行对比，发现泰妙菌素、沃尼妙林、强力霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、大观霉素与文献公布的MIC50接近，但泰乐菌素、替米考星、林可霉素却高于文献公布的MIC50数值，甚至超出IQR 范围。

体外耐药性检测结果可反映抗菌药物耐药性的发展动态，但不能代表药物体内真实的治疗效果，而且禽支原体分离培养困难，生长缓慢，因此体外耐药性检测不适合临床应用。本研究选择套式PCR 检测种蛋和孵化后期死胚的MG 感染率，来评定种鸡支原体治疗效果。结果显示，种鸡经恩诺沙星和泰妙菌素治疗后，种蛋MG 感染率均明显下降；同时据调查，与未治疗组相比，种蛋孵化率分别提高了13%和15%。这都表明两种药物对MG 治疗有效且两者治疗效果相近，证明采用套式PCR 检测种蛋或孵化后期死胚的MG 感染率，能直接、快速筛选出阻止或减少MG 经卵传播的敏感药物以及评价不同抗菌药的治疗效果。

表3 治疗5 d 后所产种蛋和孵化后期死胚套式PCR 检测结果

泰妙菌素对支原体感染具有非常好的疗效，已广泛用于家禽支原体感染的防治[9，16]。该种鸡场在使用疫苗免疫接种的同时，于产蛋期每隔1～1.5个月，使用泰妙菌素饮水预防MG 感染，却仍在约44 周龄时暴发了MG 感染，而参考文献[11]结合本研究建立的评价方法推测该场种鸡感染的MG对泰妙菌素敏感，未产生耐药性，其暴发有可能是因为种鸡不在免疫有效保护期内或在药物预防空白期内感染。