辽宁省锦州市动物园一起孔雀H7N9 流感疫情的紧急流行病学调查

兰德松，张冬野，刘 华，顾贵波，于本良

（1.辽宁省农业发展服务中心，辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳 110164；2.锦州市农业农村综合服务中心，辽宁锦州 121004；3.安徽省动物疫病预防控制中心，兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽合肥 230091）

2013年3月，我国首次在上海市和安徽省发现3 例人H7N9 流感病例[1]。研究[2-3]表明，人H7N9 流感病例是由新的重组型禽源H7N9 流感病毒感染所致。截至目前，我国已经发生了5 波人H7N9 流感疫情，其中浙江、江苏和广东等沿海省份感染病例居多[4]。研究[5-6]表明：起初H7N9 流感病毒对家禽表现为低致病力或无致病性，但在2016年底至2017年第5 波人H7N9 流感疫情流行期间，从人和禽体内均分离到高致病力的变异型H7N9 流感病毒；经病毒裂解位点分析和动物试验，发现分离毒株对鸡等家禽具有高致病力，且具备了比低致病性H7N9 毒株更强的哺乳动物体内适应能力。自2017年9月以来，农业农村部实施了家禽 H7N9 流感强制免疫与扑杀相结合的综合防治策略，取得良好的防治效果，人间感染病例明显减少。但由于部分省份活禽交易普遍以及候鸟迁徙等因素的存在，禽间的H7N9 流感疫情时有发生。近年来，国内外还发生了多起野生鸟类及家禽的高致病性H7N9 流感疫情。

2019年3月18日，辽宁省锦州市农业农村综合服务中心（以下简称“锦州市疫控中心”）兽医实验室接到锦州市动物园观赏孔雀连续两天出现异常死亡的报告。锦州市疫控中心立即组织专家组进行了现场剖检诊断，并采集死亡孔雀脏器和双拭子样品进行了实验室检测，发现为H7N9 流感病毒核酸阳性；遂即将情况上报辽宁省农业农村厅，并采集相关样品送辽宁省动物疫病预防控制中心（以下简称“辽宁省疫控中心”）检测。3月19日，经省级复检，确定为H7N9 流感疑似疫情；3月20日，经哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室进行病毒分离鉴定并测序分析，确诊为高致病性H7N9 流感疫情。3月25日，农业农村部公布了该起孔雀高致病性H7N9 流感疫情。辽宁省农业农村厅在接到锦州市疫情报告后，立即组织省级疫情处置专家组赴现场开展了紧急流行病学调查，对疫情进行了追踪溯源，评估了传播风险，同时指导疫情处置工作。

1 病例定义

1.1 临床怀疑病例

自2019年2月25日以来，在锦州市动物园饲养的孔雀等观赏禽类，以及周边家禽养殖场（户）、公园、花鸟市场及幼儿园等场所饲养的禽及其他鸟类中，出现神经症状或不明原因急性死亡的病例。

1.2 疑似病例

经锦州市疫控中心使用H7N9 双重荧光RTPCR 检测为阳性，并经辽宁省疫控中心使用H7N9双重荧光RT-PCR 复检为阳性的临床怀疑病例。

1.3 确诊病例

经哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室确诊为H7N9 流感病原学阳性的疑似病例。

2 调查方法

2.1 现场调查

采用现场勘察、访谈、问卷调查等形式，对该动物园内饲养野禽的种类、数量以及禽舍布局、饲养管理模式、免疫情况、调入调出情况、园内其他野生动物饲养管理情况等进行调查；通过与该县（区）农业农村局、农业发展服务机构疫病控制部门及动物卫生监督部门相关兽医人员座谈，了解疫点3 km 范围内的禽养殖场户分布及其养殖、免疫等基本情况，以及禽交易市场、候鸟或野鸟活动等相关情况。

2.2 临床观察及剖检

现场观察园内饲养的孔雀等野禽的临床表现，并对死亡孔雀进行解剖，观察病变情况。

2.3 样品采集

2019年3月18日，采集动物园小禽舍内病死孔雀喉头、气管、肺脏和肝脏等组织样品，咽/泄殖腔双拭子样品以及同群活孔雀血清和双拭子样品共21 份；3月19日，采集鸣禽舍和水禽舍内鸟类咽/泄殖腔双拭子样品以及环境粪便、饮水、饲料库饲料和环境、禽舍防禽网粪便等样品共70 份；4月3日，采集鸣禽舍和水禽舍内存栏鸟类咽/泄殖腔双拭子、环境水样及粪便样品30 份，采集疫点周边3 km范围内禽饲养场户、活禽交易场点、公园、花鸟鱼市场及幼儿园内的家禽或观赏禽类咽/泄殖腔双拭子、环境水样和粪便样品共551 份。

2.4 实验室检测

所有采集的组织、拭子、饮水等样品，首先经锦州市疫控中心实验室采用荧光RT-PCR 方法进行禽流感病毒核酸检测，阳性样品送辽宁省疫控中心实验室复检，同时送哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室确诊。发病期间采集的血清样品，送辽宁省疫控中心实验室进行抗体检测。

2.5 数据分析

将调查数据资料分类录入Excel，对相关数据进行分析。使用描述性流行病学方法进行疫情三间分布描述，绘制疫情流行曲线，并对疫情的风险因素来源、传播方式等提出假设并验证。

3 调查结果

3.1 基本情况

3.1.1 饲养情况 该动物园位于锦州市凌河区人民街5 段11 号（东经121.139 359、北纬41.143 571），占地24.5 公顷，包括动物观赏区13.8 公顷，其中野禽类馆舍3 处，分别为鸣禽舍、水禽舍和小禽舍。各舍间相互独立，鸣禽舍与水禽舍相邻。发病死亡孔雀所在舍为小禽舍，位于园区的最里面，与鸣禽舍和水禽舍相距约100 m。禽舍饲料近3年来由同一个供应商供货，从未更换；3 个禽舍饲喂同批饲料，最近一批饲料2019年2月初购入。各禽舍由不同饲养员负责饲喂管理，基本上不串舍；园内有专职兽医负责禽鸟的日常保健和诊疗。园内存栏的禽类均为观赏鸟类，未饲养家禽。发病前，3 个禽舍共存栏野禽394 只，其中小禽舍存栏200 只，包括孔雀155 只以及绿头鸭、雁鹅、鸸鹋、鸵鸟和鸽子等其他野禽45 只。

3.1.2 免疫情况 2018年10月，使用禽流感H5+H7 亚型三价苗开展过1 次全园观赏鸟类的集中免疫；2020年3月15日，再次使用禽流感H5+H7 亚型三价苗开展了1 次全园观赏鸟类的集中免疫，免疫剂量为1 mL/只。

3.1.3 野禽购入及调出情况 经查阅园内禽鸟档案，现场查看园内禽鸟饲养情况及询问园内管理人员，确定该动物园2年内未购入，也未售出观赏鸟类。

3.1.4 周边排查情况 发病舍周边3 km 范围内涉及凌河区、古塔区、太和区共计17 个乡（街道）、49 个村（社区），有中小型规模禽场6 个、花鸟鱼虫市场1 个，无活禽交易市场。其中的5 个禽场距疫点约3 km，1 个禽场距疫点约1.5 km，花鸟鱼虫市场距疫点约2 km；共存栏禽13.12 万只，包括家鸡、鸭、鹅、鹌鹑等12.1 万只、鸽子0.87 万只、其他观赏鸟类0.15 万只。经排查，未发现异常情况。

3.2 临床表现及剖检症状

2019年3月18日，锦州市疫控中心专家现场调查发现，有1 只孔雀表现出明显神经症状，走路摇晃不稳，翅膀触地维持平衡，头扭曲后扬，身体强直，并很快死亡。另据该动物园内兽医描述，3月17日发病死亡的孔雀中，也有1 只出现神经症状并很快死亡。现场调查发现，该小禽舍内剩余的孔雀和其他鸟类眼观均正常，个别孔雀排绿色稀便。现场对3月17日和18日发病死亡的孔雀进行剖检，仅见肠道有弥漫性出血，其他脏器均无肉眼可见病变。

3.3 三间分布

3.3.1 时间分布 2019年3月17日，该动物园小禽舍内3 只孔雀急性发病死亡；3月18日，又有6 只孔雀急性发病死亡；3月18日，锦州市疫控中心专家进行现场诊断。经过专家评估，立即对发病死亡孔雀所在小禽舍采取封锁、消毒、隔离、扑杀和无害化处理等应急处置措施，对该禽舍内剩余的191 只观赏禽进行全群扑杀和无害化处理。本次暴发的时间分布曲线见图1。

图1 死亡病例发生的时间分布曲线

3.3.2 空间分布 该动物园内饲养观赏禽的场舍共有3 处，疫情仅局限在小禽舍内（图2）。距小禽舍约100 m 处的鸣禽舍和水禽舍内饲养的丹顶鹤、白头鹤、红腹锦鸡、赤麻鸭等观赏鸟共194 只，临床表现均正常。小禽舍位于动物园园区最里面，环境更为僻静。该区域树木密度最大，数量也较鸣禽舍和水禽舍周边多很多。据园区管理人员观察，该区域内活动和栖息的野鸟明显较另两处禽舍周围多，尤其在晚上。

图2 发病禽舍空间分布

3.3.3 群间分布 本次暴发的袭击率为4.5%（9/200），仅小禽舍内饲养的孔雀发病死亡，同舍内饲养的绿头鸭、雁鹅、鸸鹋、鸵鸟和鸽子等其他观赏鸟临床表现均正常，其他2 栋禽舍内观赏鸟临床表现也均正常。

3.4 实验室检测

3月18日，锦州市疫控中心对该动物园小禽舍内采集的6 份样品（病死孔雀脏器1 份、病死孔雀拭子3 份和同群活孔雀2 份拭子）进行了禽流感病毒核酸通用型及分型荧光RT-PCR 检测，检出H7N9 流感病毒核酸阳性6 份；3月19日，锦州市疫控中心对鸣禽舍、水禽舍、禽舍防禽网和饲料料库内采集的70份样品进行了禽流感病毒核酸检测，结果均为阴性；辽宁省疫控中心对锦州市疫控中心送检的21 份样品（3 份脏器、9 份拭子和9 份血清样品）进行检测，结果发现3 份脏器、6 份拭子样品为H7N9 流感病毒核酸阳性。血清样品检测结果显示，H5 Re-8 抗体效价≥4log2 的9 份，H7 Re-2抗体效价为3log2 的5 份、2log2 的1 份、0log2 的3 份，均＜4log2，表明H5 抗体水平均合格，而H7 抗体水平均不合格；3月20日，12 份样品（脏器3 份、拭子9 份）送至国家禽流感参考实验室；3月23日，经国家禽流感参考实验室鸡胚接种分离鉴定和基因序列分析，确诊为高致病性H7N9 流感；4月3日，锦州市疫控中心对采自该动物园及周边3 km 范围内的相关样品共581 份进行了禽流感病毒核酸检测，结果均为阴性。

4 病因假设与分析

4.1 通过迁徙野鸟带毒传入的风险最高

锦州市为辽宁省西南部渤海湾的重要港口城市，地理位置特殊，气候温和，处于全球最主要的9 条候鸟迁徙通路中最繁忙的第5 条东亚-澳大利亚迁徙通道及新发现的第9 条西太平洋候鸟迁徙通道交汇处的渤海湾瓶颈区域（图3）。以锦州市的小凌河口、大凌河口及毗邻的盘锦市辽河口、营口市大辽河口组成的渤海湾滨海湿地，是全球第三大、亚洲最大的原始野生滨海湿地。每年2月底开始，有200 多种数千万只候鸟迁徙至此停歇、繁殖或越冬，到4月底或5月初离开。该动物园内树木茂密，林木覆盖率达80%以上。除禽舍有防止园内野禽外逃的防禽网外，园区内无其他防野鸟设施。据动物园饲养员介绍，2月下旬以来，园内一直有成群野鸟盘桓。现场调查时也发现，有成群野鸟飞入、飞出园区。另据世界动物卫生组织（OIE）通报，2019年1月以来，与锦州市同处两条候鸟迁徙路线上的印度、巴基斯坦、越南、俄罗斯等我国周边国家发生多起家禽及野鸟高致病性禽流感疫情。此外，禽流感抗体检测结果表明，该发病舍内的野鸟均未建立起有效的H7N9 流感免疫保护屏障。因此，迁徙野鸟带毒传入引发疫情的风险最高。

图3 候鸟迁徙路线示意图

4.2 饲料和饮水传入的风险较低

园区观赏鸟的饲料由料房统一配送，料房管理较为规范，野鸟、老鼠等进入可能性极小；对饲料库内饲料、环境和禽舍内饮水抽样进行了禽流感病毒核酸检测，结果均为阴性。在后期解除封锁前进行评估采样监测时，曾考虑是否由饲喂的猛兽饲料（主要为从固定的交易市场经检疫后购进的鸡肉）带毒传入，但对饲料库里5 份冻存鸡肉和5 份冰箱和料库环境样品进行禽流感病毒核酸检测，结果也均为阴性。因此，由饲料和饮水传入的风险较低。

4.3 人员和车辆带毒传入的风险较低

园区观赏鸟分别在3 个相对独立的禽舍内饲养，由各自饲养员负责。据陈述，2月份以来，饲养员均无与园外禽类接触史；时值3月中旬，东北地区气温较低，加上该动物园规模不大，园内动物品种数量不多，且近年来变化不大；进入园区的游客以周边的居民带着孩子参观为主，外地游客极少。同时，该动物园禁止游客自带食物饲喂动物，园区内有专门售卖饲料的摊位，主要为小袋颗粒饲料和机制玉米卷，游客可以通过防禽网或笼子，饲喂园区观赏鸟。另外，发病禽舍周边3 km 范围内也无活禽交易市场，对周边禽饲养场、环境等样品进行禽流感病毒核酸检测的结果也均为阴性。综上，由人员带毒传入的风险较低。园区内禁止外来车辆进入，仅园区配料车、绿化车等专用车辆通行，因此由外来车辆传入的风险也较低。

5 疫情扩散风险

该动物园3月17日开始出现孔雀发病并死亡，3月18日锦州市疫控中心介入调查后，初步诊断为禽流感疫情，政府对园区立即采取了封锁、消毒等控制措施。结合禽流感最长潜伏期为21 d的特征，追踪调查期设为2月25日至园区实施封锁。调查显示，此期间内该动物园内无观赏鸟调出，也未向园区外运出禽舍垫料、粪便等污染物，因此疫情由疫点向外扩散的风险较低。

6 疫情处置

3月18日，锦州市疫控中心介入调查后，通过临床观察、剖检，结合现场流行病学调查，初步怀疑为禽流感疫情，遂对整个园区采取了隔离、消毒措施；3月19日凌晨，在采样送辽宁省疫控中心复检的同时，当地政府按照《高致病性禽流感防治技术规范》，对园区采取了严格的全面封锁、消毒、隔离措施。通过风险评估确定小禽舍为疫点，并对疫点内死亡及同群观赏鸟全部扑杀并无害化处理；对园内另两处禽舍内观赏鸟、环境、饮水等开展紧急采样检测，每天对园区所有观赏鸟进行临床观察、记录，一旦有可疑情况立即报告；划定疫点周边3 km范围为疫区，10 km 范围为受威胁区，对疫区内禽类养殖场户、花鸟市场及其他相关场所进行了紧急排查并采样检测，对疫区及受威胁区所有禽类开展H7N9 流感紧急免疫。紧急免疫15 d 后，采样进行禽流感免疫抗体评估和病毒核酸检测，发现H5 和H7 抗体合格率均达到95%以上，禽流感病毒核酸均为阴性。4月9日，锦州市组织专家对疫点、疫区进行现场评估验收，认为符合解除封锁的规定，遂按照程序解除封锁。至此，该起H7N9 流感疫情被彻底扑灭。

7 讨论

本次疫情为国内首次报道的一起孔雀高致病性H7N9 流感疫情。通过紧急流行病学调查并未找到确切的疫情传入来源，但通过风险分析，综合考虑疫情暴发时间、野鸟迁徙路线、周边国家疫情情况、疫点周边3 km 范围内禽类养殖场户及其他相关场所的排查及检测情况，推测疫情由迁徙野鸟带毒传入引发的风险较高。锦州市疫控中心从禽舍防禽网上及园区环境中采集的10 份鸟粪便拭子样品中并未检出禽流感病毒核酸，这可能与采样时机不对、样本数量不足等因素有关。因此，建议今后在野鸟迁徙季节，持续加强对迁徙野鸟的禽流感主动监测，为禽流感的及时预警和制定精准防控措施，提供更为确实可靠的科学数据支撑。风险评估表明，病原由饲料、饮水、人员和车辆等传入的风险较低，也排除由调入禽类传入的可能。该园区内未制定科学的禽流感免疫程序，未及时开展H7N9 流感疫苗免疫，导致园内饲养禽类抗体水平未达到群体保护水平，这是该起疫情发生的内在诱因。通过采取科学处置措施，并经过排查和监测评估，证实该起疫情未发生扩散，最终确定该起疫情被成功扑灭。

本次疫情提示，必须高度重视禽流感的强制免疫工作。禽类养殖场户、观赏鸟及花鸟市场等禽类养殖相关场所，应制定科学免疫程序，及时开展禽流感免疫工作，定期开展禽流感免疫抗体水平监测和评估，并做好新生禽类的补免工作，保证禽流感免疫及时到位，确保不留免疫空档期，使禽群持续保持坚实免疫屏障；同时禽类相关场所应建立生物安全体系，制定科学的生物安全防控措施，提高生物安全水平，做好防止野鸟进入以及人员管理、场所消毒、无害化处理等各项具体防控工作。