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新疆乌鲁木齐市某活禽交易市场禽流感流行病学调查

2020-09-07刘文伟

中国动物检疫 2020年9期
关键词:活禽免疫抗体亚型

韩 涌,王 涛,张 震,刘文伟

(1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心,新疆乌鲁木齐 830063;2.新疆农业大学,新疆乌鲁木齐 830091)

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科A 型流感病毒,根据其粒子表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同,可分为不同亚型。目前已发现有18 种HA 亚型和11种NA 亚型[1],其中H1—H16、N1—N9 各亚型流感病毒均可在禽类中分离到,而其他亚型毒株来源于蝙蝠[2]。根据病毒致病性不同,可将AIV 分为高致病性、低致病性和无致病性[3]。世界动物卫生组织(OIE)将高致病性禽流感列为须通报动物疫病,我国将其列为一类动物疫病[4]。

H9N2亚型禽流感1994年首次暴发于广东省,后逐渐扩散至我国其他区域,并成为我国家禽中流行的主要亚型[5-6]。AIV 还可感染包括犬、猫[7]、猪[8]和雪貂[9]在内的多种哺乳动物。1998年,我国报道了首例人H9N2 亚型禽流感病例[10];1997年5月,我国香港首次报道发生了H5N1 亚型AIV 传染人并引起死亡的事件[11]。因此,AIV 严重影响了全世界养禽业的发展,并对人类健康构成了威胁。

研究[12]表明,活禽交易市场是AIV 向外传播的主要来源地。乌鲁木齐市活禽交易市场禽类交易频繁,活禽来源较为分散,本地活禽交易量较小;市场内活禽种类繁多,且长期密切接触;市场环境高湿,环境消毒不及时、不彻底。这些都为病毒传播提供了有利条件[13],也导致交易市场成为AIV跨物种传播的重要环节[14-15]。冬季是禽流感高发季节。为了解冬季新疆乌鲁木齐市活禽市场交易活禽的AIV 感染情况,以便采取措施降低AIV 通过活禽交易市场向外传播以及感染人的风险,2019年11月至2020年1月开展了本次调查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 柱式RNA 核酸提取试剂盒(批号YRNA-TQ 20190926P)、AIV 通用型荧光定量RT-PCR 检测试剂盒(批号AIV20191018P),均由哈尔滨元亨生物药业有限公司提供;H5、H7 和H9 亚型AIV 三重荧光定量RT-PCR 检测试剂盒(批号60050),深圳澳东检验检测有限公司提供;AI-H5(Re11)株抗原(批号20191012)、阳性血清(批号20191011)、AI-H5(Re12)株抗原(批号20190828)、阳性血清(批号20190925);AI-H7(Re2)株抗原(批 号201900416)、阳性血清(批号20180901)、阴性血清(批号20180426),均购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要仪器 高速冷冻离心机(型号3K15),购自德国Sigma 公司;实时荧光定量PCR 仪(型号QuantStudio 5),购自美国赛默飞公司;电热式恒温水浴锅(型号DM0421),购自北京市医疗设备有限公司;可调式漩涡振荡器(型号MX-S),购自大龙器械有限公司;瞬时离心机(型号MinX-5),购自美国ABI 公司。

1.1.3 样本 血清样本:用2.5 mL 一次性采血器采集2 mL 全血,一一对应编号,放至室温自然析出血清,用1.5 mL 离心管收集淡黄色清亮血清,共采集85 份血清样本。棉拭子样本:采集交易活禽的泄殖腔/咽喉棉拭子(103 份)和2 个大型活禽运输车辆出入通道环境拭子(40 份),共143份。将采集的样本放入装有冰袋的采样箱内送至实验室。本次调查所采集的样品于2019年11月至2020年1月分3 次采集,具体信息见表1。

表1 血清样品来源及采集时间

1.2 方法

1.2.1 免疫抗体检测 按照标准GB/T 18936—2003 中的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验方法,分别检测活禽血清样本的H5(Re-11)、H5(Re-12)、H7(Re-2)AIV 抗体。抗体效价≥log24为免疫免疫抗体合格。

1.2.2 核酸检测

1.2.2.1 样品灭活 将采集的棉拭子样品放入恒温水浴锅中56 ℃ 30 min 灭活。

1.2.2.2 核酸提取 将水浴锅中的棉拭子取出,置于振荡器充分震荡;参照柱式RNA 核酸提取试剂盒说明书进行RNA 核酸提取,将提取后的核酸放至-20 ℃保存待检测。

1.2.2.3 核酸检测 将提取的RNA 核酸,参照AIV 通用型荧光定量RT-PCR 检测剂盒说明书进行检测。

1.2.2.4 核酸分型 将通用型AIV 核酸检测为阳性的核酸,参照H5、H7 和H9 亚型AIV 三重荧光定量RT-PCR 检测试剂盒进行分型,对阴性样品定义为未分型。

2 结果与分析

2.1 免疫抗体检测

85 份活禽血清样本中,H5(Re-11)株免疫抗体合格50 份,合格率为58.8%;H5(Re-12)株免疫抗体合格52 份,合格率为61.2%;H7(Re-2)株免疫抗体合格54 份,合格率为63.5%。由图1 可以看出,市场交易活禽流感免疫抗体水平普遍不高,低于农业农村部要求的70%的最低标准,抗体效价大部分低于log24,且免疫抗体合格样品效价也临近临界值,效价点密集分布在 log23~log25之间。

图1 85 份血清样品的禽流感免疫抗体效价分布

2.2 病毒核酸检测

2.2.1 活禽棉拭子核酸检测 在采集的鸡、鸭、鹅、鸽4 种禽类103 份活禽泄殖腔/咽喉棉拭子中,检出AIV 核酸阳性29 份,阳性率为28.15%。各种禽类样品的检测结果及PCR 检测结果分别见表2、图2。从表2 可以看出,鹅和鸭阳性率较高,鸡和鸽子较低,说明水禽的AIV 感染率较高。该结果符合禽流感的流行病学特征。从图2 可以看出,活禽棉拭子核酸阳性较强,出现S 形曲线的Ct 值较小,荧光信号出现较早,表明样品质量能够满足试验要求。

表2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸检测结果

2.2.2 外环境AIV 核酸检测 在2 个开放通道采集的40 份环境棉拭子中,检出AIV 核酸阳性7 份,阳性率为17.5%。PCR 阳性检测结果见图3。这说明2 个开放式通道虽然通风效果较好,但依然存在AIV 污染。

图2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸荧光PCR 检测结果

图3 活禽交易区外环境AIV 核酸荧光PCR 检测结果

2.3 核酸分型

36 份AIV 核酸阳性样品,经H5、H7 和H9亚型三重荧光定量RT-PCR 检测,检出H5 亚型3份,阳性率为8.33%;H9 亚型22 份,阳性率为61.11%;未定型11 份,阳性率为30.56%。具体结果详见表2、图4~5。从表2 可以看出,活禽市场内的交易活禽以感染H9 亚型AIV 为主,占比61.11%;H5 亚型次之,占比8.33%,H7 亚型最低,为0。从活禽种类来看,鸭、鹅等水禽以感染H9亚型AIV 为主。市场通道环境中,未检出H5、H7和H9 亚型病毒。

3 讨论

3.1 交易活禽流感免疫抗体情况

H5、H7 亚型禽流感属于国家强制免疫的重大动物疫病,养殖环节的整体免疫抗体合格率需≥70%,免疫密度≥95%。2019年下半年开始,乌鲁木齐市用新的H5(Re-11、Re-12)+H7(Re-2)三价苗进行强制免疫。但从此次调查结果来看,交易活禽的免疫抗体水平普遍较低。其原因可能有以下两点:一是养殖场户忽视对即将进入交易环节活禽的H5、H7 亚型禽流感免疫;二是部分养殖户仍使用库存的未更新毒株的禽流感疫苗免疫,而此次检测的是新毒株疫苗的免疫抗体。

表3 不同类型样本禽流感病毒核酸分型情况比较

图4 H5 亚型AIV 核酸荧光PCR 检测结果

图5 H9 亚型AIV 核酸荧光PCR 检测结果

3.2 交易市场内部活禽AIV 污染状况

对不同禽类的AIV 核酸检测结果显示,鸭和鹅等水禽的阳性率较高,而鸡最低,这与鸭和鹅等水禽是AIV 自然宿主这一结论一致[16],也提示活禽市场需加强对水禽的禽流感防控[17]。AIV 各亚型核酸检测结果显示,H5 亚型阳性率为8.33%,H9 亚型为61.11%,未检出H7 亚型,这与目前流行于我国的AIV 主要是H5 和H9 亚型的结论一致[18-19]。

3.3 交易市场内部活禽管理情况

调查发现,该活禽市场环境湿度较高,活禽来源分散,存放密度较大,这为病毒传播提供了有利条件。此外,各档口存留活禽仍放在市场交易区,无法实现活禽“零过夜”。这将造成病毒在环境中持续存在,从而为病毒重配产生新的病毒亚型提供了条件。

据调查[20],活禽交易市场内活禽运输车、活禽档口以及活禽屠宰点3 个主要环节AIV 核酸污染状况较严重,是市场防控AIV 流行的关键风险点。结合本次调查的进入市场活禽H5、H7 免疫抗体水平低而H5、H9 亚型禽流感污染状况较严重,提示应做好以下工作:加大活禽交易市场监管力度,每天清洗消毒,包括市场内和进出市场的通道,坚持“一日一清洗、一周一消毒、一周一休市、活禽零过夜”的市场管理制度;重点加强水禽监测,杜绝水禽和陆禽混合交易;在养殖环节,加强禽流感免疫,提高禽流感的免疫保护水平。

4 结论

调查发现,该交易市场交易活禽和对外通道中都存在比较严重H9 和H5 亚型AIV 污染,且交易活禽H5、H7 禽流感免疫抗体水平较低,已不能起到有效的保护作用,因而需要通过加强市场监管和清洗消毒,来降低市场内禽流感疫情的暴发和散播风险。

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