新疆乌鲁木齐市某活禽交易市场禽流感流行病学调查

韩 涌，王 涛，张 震，刘文伟

（1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐 830063；2.新疆农业大学，新疆乌鲁木齐 830091）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属于正黏病毒科A 型流感病毒，根据其粒子表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，可分为不同亚型。目前已发现有18 种HA 亚型和11种NA 亚型[1]，其中H1—H16、N1—N9 各亚型流感病毒均可在禽类中分离到，而其他亚型毒株来源于蝙蝠[2]。根据病毒致病性不同，可将AIV 分为高致病性、低致病性和无致病性[3]。世界动物卫生组织（OIE）将高致病性禽流感列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[4]。

H9N2亚型禽流感1994年首次暴发于广东省，后逐渐扩散至我国其他区域，并成为我国家禽中流行的主要亚型[5-6]。AIV 还可感染包括犬、猫[7]、猪[8]和雪貂[9]在内的多种哺乳动物。1998年，我国报道了首例人H9N2 亚型禽流感病例[10]；1997年5月，我国香港首次报道发生了H5N1 亚型AIV 传染人并引起死亡的事件[11]。因此，AIV 严重影响了全世界养禽业的发展，并对人类健康构成了威胁。

研究[12]表明，活禽交易市场是AIV 向外传播的主要来源地。乌鲁木齐市活禽交易市场禽类交易频繁，活禽来源较为分散，本地活禽交易量较小；市场内活禽种类繁多，且长期密切接触；市场环境高湿，环境消毒不及时、不彻底。这些都为病毒传播提供了有利条件[13]，也导致交易市场成为AIV跨物种传播的重要环节[14-15]。冬季是禽流感高发季节。为了解冬季新疆乌鲁木齐市活禽市场交易活禽的AIV 感染情况，以便采取措施降低AIV 通过活禽交易市场向外传播以及感染人的风险，2019年11月至2020年1月开展了本次调查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 柱式RNA 核酸提取试剂盒（批号YRNA-TQ 20190926P）、AIV 通用型荧光定量RT-PCR 检测试剂盒（批号AIV20191018P），均由哈尔滨元亨生物药业有限公司提供；H5、H7 和H9 亚型AIV 三重荧光定量RT-PCR 检测试剂盒（批号60050），深圳澳东检验检测有限公司提供；AI-H5（Re11）株抗原（批号20191012）、阳性血清（批号20191011）、AI-H5（Re12）株抗原（批号20190828）、阳性血清（批号20190925）；AI-H7（Re2）株抗原（批 号201900416）、阳性血清（批号20180901）、阴性血清（批号20180426），均购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要仪器 高速冷冻离心机（型号3K15），购自德国Sigma 公司；实时荧光定量PCR 仪（型号QuantStudio 5），购自美国赛默飞公司；电热式恒温水浴锅（型号DM0421），购自北京市医疗设备有限公司；可调式漩涡振荡器（型号MX-S），购自大龙器械有限公司；瞬时离心机（型号MinX-5），购自美国ABI 公司。

1.1.3 样本 血清样本：用2.5 mL 一次性采血器采集2 mL 全血，一一对应编号，放至室温自然析出血清，用1.5 mL 离心管收集淡黄色清亮血清，共采集85 份血清样本。棉拭子样本：采集交易活禽的泄殖腔/咽喉棉拭子（103 份）和2 个大型活禽运输车辆出入通道环境拭子（40 份），共143份。将采集的样本放入装有冰袋的采样箱内送至实验室。本次调查所采集的样品于2019年11月至2020年1月分3 次采集，具体信息见表1。

表1 血清样品来源及采集时间

1.2 方法

1.2.1 免疫抗体检测 按照标准GB/T 18936—2003 中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验方法，分别检测活禽血清样本的H5（Re-11）、H5（Re-12）、H7（Re-2）AIV 抗体。抗体效价≥log24为免疫免疫抗体合格。

1.2.2 核酸检测

1.2.2.1 样品灭活 将采集的棉拭子样品放入恒温水浴锅中56 ℃ 30 min 灭活。

1.2.2.2 核酸提取 将水浴锅中的棉拭子取出，置于振荡器充分震荡；参照柱式RNA 核酸提取试剂盒说明书进行RNA 核酸提取，将提取后的核酸放至-20 ℃保存待检测。

1.2.2.3 核酸检测 将提取的RNA 核酸，参照AIV 通用型荧光定量RT-PCR 检测剂盒说明书进行检测。

1.2.2.4 核酸分型 将通用型AIV 核酸检测为阳性的核酸，参照H5、H7 和H9 亚型AIV 三重荧光定量RT-PCR 检测试剂盒进行分型，对阴性样品定义为未分型。

2 结果与分析

2.1 免疫抗体检测

85 份活禽血清样本中，H5（Re-11）株免疫抗体合格50 份，合格率为58.8%；H5（Re-12）株免疫抗体合格52 份，合格率为61.2%；H7（Re-2）株免疫抗体合格54 份，合格率为63.5%。由图1 可以看出，市场交易活禽流感免疫抗体水平普遍不高，低于农业农村部要求的70%的最低标准，抗体效价大部分低于log24，且免疫抗体合格样品效价也临近临界值，效价点密集分布在 log23～log25之间。

图1 85 份血清样品的禽流感免疫抗体效价分布

2.2 病毒核酸检测

2.2.1 活禽棉拭子核酸检测 在采集的鸡、鸭、鹅、鸽4 种禽类103 份活禽泄殖腔/咽喉棉拭子中，检出AIV 核酸阳性29 份，阳性率为28.15%。各种禽类样品的检测结果及PCR 检测结果分别见表2、图2。从表2 可以看出，鹅和鸭阳性率较高，鸡和鸽子较低，说明水禽的AIV 感染率较高。该结果符合禽流感的流行病学特征。从图2 可以看出，活禽棉拭子核酸阳性较强，出现S 形曲线的Ct 值较小，荧光信号出现较早，表明样品质量能够满足试验要求。

表2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸检测结果

2.2.2 外环境AIV 核酸检测 在2 个开放通道采集的40 份环境棉拭子中，检出AIV 核酸阳性7 份，阳性率为17.5%。PCR 阳性检测结果见图3。这说明2 个开放式通道虽然通风效果较好，但依然存在AIV 污染。

图2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸荧光PCR 检测结果

图3 活禽交易区外环境AIV 核酸荧光PCR 检测结果

2.3 核酸分型

36 份AIV 核酸阳性样品，经H5、H7 和H9亚型三重荧光定量RT-PCR 检测，检出H5 亚型3份，阳性率为8.33%；H9 亚型22 份，阳性率为61.11%；未定型11 份，阳性率为30.56%。具体结果详见表2、图4～5。从表2 可以看出，活禽市场内的交易活禽以感染H9 亚型AIV 为主，占比61.11%；H5 亚型次之，占比8.33%，H7 亚型最低，为0。从活禽种类来看，鸭、鹅等水禽以感染H9亚型AIV 为主。市场通道环境中，未检出H5、H7和H9 亚型病毒。

3 讨论

3.1 交易活禽流感免疫抗体情况

H5、H7 亚型禽流感属于国家强制免疫的重大动物疫病，养殖环节的整体免疫抗体合格率需≥70%，免疫密度≥95%。2019年下半年开始，乌鲁木齐市用新的H5（Re-11、Re-12）+H7（Re-2）三价苗进行强制免疫。但从此次调查结果来看，交易活禽的免疫抗体水平普遍较低。其原因可能有以下两点：一是养殖场户忽视对即将进入交易环节活禽的H5、H7 亚型禽流感免疫；二是部分养殖户仍使用库存的未更新毒株的禽流感疫苗免疫，而此次检测的是新毒株疫苗的免疫抗体。

表3 不同类型样本禽流感病毒核酸分型情况比较

图4 H5 亚型AIV 核酸荧光PCR 检测结果

图5 H9 亚型AIV 核酸荧光PCR 检测结果

3.2 交易市场内部活禽AIV 污染状况

对不同禽类的AIV 核酸检测结果显示，鸭和鹅等水禽的阳性率较高，而鸡最低，这与鸭和鹅等水禽是AIV 自然宿主这一结论一致[16]，也提示活禽市场需加强对水禽的禽流感防控[17]。AIV 各亚型核酸检测结果显示，H5 亚型阳性率为8.33%，H9 亚型为61.11%，未检出H7 亚型，这与目前流行于我国的AIV 主要是H5 和H9 亚型的结论一致[18-19]。

3.3 交易市场内部活禽管理情况

调查发现，该活禽市场环境湿度较高，活禽来源分散，存放密度较大，这为病毒传播提供了有利条件。此外，各档口存留活禽仍放在市场交易区，无法实现活禽“零过夜”。这将造成病毒在环境中持续存在，从而为病毒重配产生新的病毒亚型提供了条件。

据调查[20]，活禽交易市场内活禽运输车、活禽档口以及活禽屠宰点3 个主要环节AIV 核酸污染状况较严重，是市场防控AIV 流行的关键风险点。结合本次调查的进入市场活禽H5、H7 免疫抗体水平低而H5、H9 亚型禽流感污染状况较严重，提示应做好以下工作：加大活禽交易市场监管力度，每天清洗消毒，包括市场内和进出市场的通道，坚持“一日一清洗、一周一消毒、一周一休市、活禽零过夜”的市场管理制度；重点加强水禽监测，杜绝水禽和陆禽混合交易；在养殖环节，加强禽流感免疫，提高禽流感的免疫保护水平。

4 结论

调查发现，该交易市场交易活禽和对外通道中都存在比较严重H9 和H5 亚型AIV 污染，且交易活禽H5、H7 禽流感免疫抗体水平较低，已不能起到有效的保护作用，因而需要通过加强市场监管和清洗消毒，来降低市场内禽流感疫情的暴发和散播风险。