山东某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床感染特征及耐药基因分析

陆书华， 李晓哲， 刘凌云， 金呈强， 戈宁宁， 董海新

（济宁医学院附属医院，山东 济宁 272000）

随着碳青霉烯类抗菌药物在临床的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）的分离率逐年增加。CRE的耐药机制极为复杂，是临床抗感染治疗的难点。本研究旨在探讨济宁医学院附属医院CRE的临床感染特征、药物敏感性及基因分型，为预防和治疗CRE感染及医院多重耐药菌管理提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集济宁医学院附属医院2017年7月—2018年12月CRE非重复临床分离株，-80℃保存。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）均由我国国家卫生健康委员会临床检验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定及体外药物敏感性试验 菌种经复温、增菌、培养后，根据《全国临床检验操作规程》（第4版）要求进行分离培养。所有菌株经VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统及配套革兰阴性菌鉴定卡（法国生物梅里埃公司）进行细菌鉴定，并采用VITEK-MS全自动快速微生物质谱检测系统（法国生物梅里埃公司）确证。采用稀释法测定CRE最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），抗菌药物包括替加环素、头孢唑啉、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、替卡西林-克拉维酸、阿米卡星、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、厄他培南、氨曲南、复方磺胺甲噁唑、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、头孢吡肟、头孢他啶、头孢哌酮-舒巴坦、头孢替坦、妥布霉素、四环素。头孢哌酮-舒巴坦采用纸片扩散法测定抑菌环直径，结果判定参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018年版标准；替加环素采用E试验试纸条（法国生物梅里埃公司）测定MIC，结果判定参照美国食品与药品监督管理局（U. S. Food and Drug Administration，FDA）推荐的解释标准，MIC≤2.0 mg/L为敏感，MIC=4.0 mg/L为中介，MIC≥8.0 mg/L为耐药。

1.2.2 简易碳青霉烯类灭活（simplified carbapenem inactivation method，sCIM）试验 将过夜生长的大肠埃希菌（ATCC 25922）用肉汤调到0.5麦氏单位，直接涂布于M-H平板，将直接粘取待测CRE后的亚胺培南药物敏感性试验纸片放入涂有大肠埃希菌（ATCC 25922）的M-H平板，35 ℃培养16～18 h后，测量抑菌环直径，抑菌环直径＜20 mm或为21～22 mm，环中大肠埃希菌菌落出现卫星现象为阳性；抑菌环直径＞25 mm为阴性；介于二者之间为不确定[1]。

1.2.3 Xpert Carba-R检测 将大肠埃希菌（ATCC 25922）及待测菌株用0.9%氯化钠溶液调至0.5麦氏单位，取2 mL菌液放入样本处理液中，涡旋震荡10 s，用新的移液管取2 mL液体加入试剂匣，然后放入仪器检测，约1 h后读取结果。

1.2.4 基因检测 采用加热煮沸法（100 ℃干浴10 min）提取菌株DNA模板，通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48基因序列，引物信息见表1，引物设计参考文献[2-3]。扩增程序：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 45 s变性；退火时间35 s，72 ℃ 50 s延伸，35个循环；72 ℃ 8 min再延伸。于2%琼脂糖凝胶中扩增产物，用GelRed核酸染色剂染色，在Gel-Box凝胶成像系统中拍照并记录结果。回收预期目的片段大小一致的PCR产物进行测序，所得碱基基因序列与美国国立生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中的已知序列进行比对，确证扩增产物的基因型别。

1.3 统计学方法

采用WHONET 5.4软件进行数据处理与药物敏感性试验结果的统计学分析。

表1 碳青霉烯酶PCR引物信息

2 结果

2.1 CRE分离情况

2017年7月—2018年12月，济宁医学院附属医院送检CRE的患者231例，有87例检出CRE，其中6例患者不同部位的临床样本中同时检出CRE。剔除同一患者相同部位的重复菌株，本研究纳入CRE 93株。

2.1.1 CRE样本来源 93株CRE临床分离株中，有52株（55.91%）分离自痰液样本，11株（11.83%）分离自血液样本，8株（8.60%）分离自中段尿样本，5株（5.38%）分离自肺泡灌洗液样本，4株（4.30%）分离自分泌物样本，脓液、胆汁样本中各分离出3株（3.23%），脑脊液、穿刺液和引流液样本中各分离出2株（2.15%），胸水样本中分离出1株（1.07%）。

2.1.2 CRE科室分布 CRE主要分离自重症监护病房（45株，48.39%），以下依次为：康复科（9株，9.68%），呼吸内科（6株，6.45%），血液科（5株，5.38%），肝胆科、创伤骨科、儿科各4株（4.30%），神经内科、急诊科各3株（3.23%），神经外科监护病房、肾内科各2株（2.15%），泌尿科、烧伤科、神经外科、胃肠外科、手足外科、小儿外科各1株（1.08%）。

2.1.3 CRE菌种分布 93株CRE临床分离株中，肺炎克雷伯菌59株（63.44%）、大肠埃希菌29株（31.18%）、阴沟肠杆菌4株（4.30%）、弗劳地柠檬酸杆菌1株（1.08%）。

2.2 体外药物敏感性试验结果

93株CRE对24种临床常用抗菌药物的耐药率见表2。

表2 CRE对24种抗菌药物的耐药率 %

2.3 sCIM试验结果

93株CRE临床分离株中，有79株（84.95%）产碳青霉烯酶，其中肺炎克雷伯菌52株、大肠埃希菌23株、阴沟肠杆菌3株、弗劳地柠檬酸杆菌1株。部分结果见图1。

2.4 Xpert Carba-R检测结果

79株产碳青霉烯酶CRE中，KPC基因阳性38株（48.10%），NDM基因阳性31株（39.24%），IMP基因阳性6株（7.59%），NDM+KPC基因阳性4株（5.06%），未检出VIM及OXA-48 耐药基因。

图1 部分sCIM试验结果

图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

2.5 PCR基因扩增结果

52株肺炎克雷伯菌中，38株携带KPC耐药基因，10株携带NDM耐药基因，4株同时携带KPC和NDM耐药基因。23株大肠埃希菌中，18株携带NDM耐药基因，5株携带IMP耐药基因。3株阴沟肠杆菌中，2株携带NDM耐药基，1株携带IMP耐药基因。1株弗劳地柠檬酸杆菌携带NDM耐药基。有14株CRE未检出本研究涉及的耐药基因，未检出VIM及OXA-48耐药基因。扩增产物KPC测序结果与NCBI数据库中的基因登录号（KU680813.1）完全一致，即为KPC-2；扩增产物IMP测序结果与NCBI数据库中的基因登录号（KU051710.1）完全一致，即为IMP-4；扩增产物NDM测序结果与NCBI数据库中的基因登录号（JF826285.1 ）完全一致，即为NDM-1。见图2。

3 讨论

近年来，CRE在世界范围内散发或暴发流行，对全球的公共卫生构成了重大威胁[4]，2017年，世界卫生组织将CRE列为21世纪最重要的耐药病原菌之一。目前CRE分离率较高的国家除我国外，还包括希腊、意大利、巴西，以及美国和哥伦比亚[5-6]。有研究结果表明，2014—2015年，我国27个省市的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌的碳青霉烯类耐药率分别为8%和2%；收集的999株CRE中，肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肠杆菌科细菌所占比例分别为70%、16%和13%，其中92%的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产碳青霉烯酶；KPC（63%）和NDM（34%）仍是主要的产酶类型，且有2%的菌株同时表达KPC和NDM基因[7]。

济宁医学院附属医院CRE的分离率也在逐年增加，2015年上报多重耐药菌1 245株，其中CRE 24株（1.93%）；2016年上报多重耐药菌1 406株，其中CRE 30株（2.13%）；2017年上报多重耐药菌2 463株，其中CRE 100株（4.06%）；2018年上报多重耐药菌2 703株，其中CRE 166株（6.14%）。CRE主要分离自痰液样本，其次是血液和尿液样本，这与济宁医学院附属医院样本结构有关。CRE主要分布在重症监护病房，可能与重症监护病房患者病因复杂且病情危重，高效广谱抗菌药物使用率高和有创操作治疗较多有关[8]。

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的机制包括产碳青霉烯酶和非产碳青霉烯酶2类，其中产碳青霉烯酶是主要的耐药机制。碳青霉烯酶基因常位于MDR质粒上，可在不同肠杆菌科细菌之间传播。按照Ambler分子分类方法可将碳青霉烯酶分为A、B、D 3类，A类包括KPC、IMI、NMC、SME和GES等，B类也称为金属酶，包括IMP、VIM、NDM、SPM和GIM等，D类包括OXA-48、OXA-181、OXA-204和OXA-232。其中，A类酶中的KPC，B类酶中的NDM、VIM和IMP，以及D类酶中的OXA-48是肠杆菌科细菌中最常见的碳青霉烯酶。

实验室可以通过碳青霉烯酶表型试验或碳青霉烯酶耐药基因的分子生物学试验来检测CRE。碳青霉烯酶表型检测试验包括改良Hodge试验、Carba NP试验、碳青霉烯类灭活（carbapenem inactivation method，CIM）试验、乙二胺四乙酸-碳青霉烯类灭活（ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）试验等[9]。近年来也有研究者通过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱检测碳青霉烯类抗菌药物的水解来检测碳青霉烯酶的活性。本研究采用一种新的碳青霉烯酶表型确证方法——sCIM，检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶，sCIM与mCIM检测原理相似，都是基于碳青霉烯酶能水解碳青霉烯类抗菌药物，但sCIM操作方法较mCIM更简单，更加适合临床实验室常规操作，在分析的93株CRE临床分离株中，84.95%产生碳青霉烯酶，与ZHANG等[10]的研究结果基本一致。本研究采用Xpert Carba-R，48 min检测KPC、NDM、VIM、OXA和IMP-1 5种碳青霉烯酶基因，是目前唯一可快速检测并鉴别多种碳青霉烯酶基因的即时分子诊断方法，可直接检测尿、拭子等临床样本，样本处理只需简单的3个步骤，耗时仅1 min，上机检测后48 min即可获得检测结果，每种基因的检测下限都可达102 CFU/拭子，可快速发现耐碳青霉烯酶菌株定植患者。Xpert Carba-R对应的敏感性及特异性分别为94.5%和100%，检测时长仅48 min，为最快出结果的检测方法。通过检测及结果对比，sCIM试验确证碳青霉烯酶表型与PCR金标准的符合率为100%，Xpert Carba-R碳青霉烯酶检出率与PCR金标准的符合率为100%。综合多种CRE检测方法，本研究建议使用sCIM法简便地确证肠杆菌科细菌碳青霉烯酶，对于急症患者宜采用Xpert Carba-R检测并鉴别碳青霉烯酶分型。

本研究测序验证后的结果表明，93株CRE中有79株产碳青霉烯酶，其他为非产碳青霉烯酶菌株，可能为高产AmpC酶或超广谱β-内酰胺酶合并外膜蛋白缺失以及外排泵过表达联合外膜蛋白缺失所致。本研究中88%（52/59）的肺炎克雷伯菌，79%（23/29）的大肠埃希菌和75%（3/4）的阴沟肠杆菌携带碳青霉烯酶基因。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶耐药基因主要为KPC型，大肠埃希菌主要为NDM型，与WANG等[11]的研究结果一致，可能是因为产KPC和NDM型耐药基因均可由质粒介导，可通过菌株自身克隆以及不同菌种间水平转移，导致耐药菌株的广泛传播。

目前，碳青霉烯类抗菌药物是唯一可选的治疗产超广谱β-内酰胺酶革兰阴性细菌感染的抗菌药物，然而CRE不但可以水解碳青霉烯类药物，而且可以使头孢菌素类、青霉素类等抗菌药物失效，并对其他种类的抗菌药物不同程度耐药[12]。 使用单一抗菌药物进行治疗的成功率非常低，只有多种抗菌药物联合使用才能提高成功率。

综上所述，CRE管理的核心问题在于：（1）快速甄别产碳青霉烯酶菌株，遏制其快速发展；（2）确定早期、快速筛查的方法，并结合全基因组测序等多种方法，对CRE感染快速溯源其传播链条；（3）探索基于体外MIC的联合方案下不同药物组合[13]。临床医师需要准确掌握细菌耐药情况，根据药物敏感性试验结果合理使用抗菌药物，减少耐药菌的产生。

本研究明确了济宁医学院附属医院CRE的临床分布特征及耐药基因，有助于及时遏制CRE的持续感染与流行，降低医院CRE感染发生率，协助临床医师制定抗菌药物使用策略，为医院多重耐药菌管理提供参考。