基于网络药理学探讨半夏治疗直肠癌的作用机制

杭州市第三人民医院 杭州 310002

直肠癌（rectal cancer）是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤中具有较高的发病率和死亡率[1]。由于现代人群饮食结构和生活方式的改变，直肠癌发病年龄更加趋于年轻化[2-3]。在过去的8年里，中老年人患者就诊率最高，男性患者就诊率约为女性的1.5倍[4]。直肠癌的症状主要以便中带血、腹部不适、大便习惯改变和腹部包块为主，其次为贫血和其他复合症状[5-6]。本病治疗困难，预后不良，西医治疗以根治性手术、姑息性手术、放化疗和靶向治疗为主，手术术后复发率高，而其他治疗均存在相应的局限性[7-9]。近年来，中医药治疗逐渐成为直肠癌防治的新方案，研究发现，中药具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等功效，进而能够达到抑制肿瘤发展、减轻症状以及提高生活质量的目的[10-12]。

中医认为，直肠癌是由于湿热瘀毒等病理产物蓄积体内，导致脏腑功能紊乱而发，通常应用化痰除湿、清热解毒、消肿散结等法治疗。各中医大家在治疗直肠癌时，大量使用茯苓、白术、半夏、陈皮等利水渗湿、活血化瘀类药物，同时辅以党参、黄芪等扶正药物[13-15]。半夏又名地文、裂刀草，属天南星科，主要分布在四川、湖北、江苏等地，辛、温、有毒，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、消痞散结、解毒消肿等功效。由于中药所含成分多样，作用机制复杂，故很难确定其有效化学成分。本文通过网络药理学综合分析半夏的组成成分，探索半夏与直肠癌的共同靶点，并分析涉及的生物学功能和信号通路，以剖析半夏治疗直肠癌的作用机制，现将研究成果报道如下。

1 资料和方法

1.1 筛选半夏的关键化学成分 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）检索半夏所有的有效成分，共收集到116种化合物，再以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%、药物相似性（drug-likeness，DL）＞0.18为标准，对化合物的药物动力学进行筛选。OB是指药物经口服给药后被机体吸收进入血液循环的相对量和速率，DL反映化合物中的特定功能基团与已知药物的相似性，二者对中药化学成分活性的评估具有重要意义。

1.2 筛选半夏-直肠癌共同作用靶点 利用TCMSP搜索半夏关键化学成分的靶点信息，并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）查询与靶点相对应的人类基因名称，再与通过基因组注释数据库平台（genome annotation database platform，Gene Cards）（https://www.genecards.org/）、人类孟德尔遗传 （Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https://www.omim.org/）筛选出的直肠癌靶点基因进行映射，得到药物-疾病靶点基因。

1.3 药物-关键化学成分-疾病靶点的网络可视化 为了研究半夏治疗直肠癌的作用机制，本研究将半夏-直肠癌的共同化学成分和共同靶点基因导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理，将药物-关键化学成分-疾病靶点以网络图的形式呈现。在这个网络图中，关键化学成分和疾病靶点以节点表示，节点之间相互作用的关系以边来表示。

1.4 蛋白间相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建 将半夏与直肠癌的共同靶点基因导入String数据库（https://string-db.org/Version 10.5），选择研究物种为人类（Homo sapiens），设PPI评分＞0.7，得到PPI关系网络，隐藏出现的游离蛋白，下载PPI关系图，并筛选排名前15的PPI网络核心基因。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通过Bioconductor数据库（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查询药物-疾病共同靶点基因的基因身份（identity，ID）。利用R语言安装Bioconductor平台相关安装包，设置P值=0.05，Q值=0.05，进行GO富集分析和KEGG富集分析，输出结果并绘制barplot柱状图。

2 结果

2.1 半夏中化学成分的筛选 通过TCMSP获得半夏的有效化合物共116种，再经OB＞30%、DL＞0.18的标准进行筛选，得到半夏的关键化学成分13种，包括卡维丁、黄芩素、黄芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇、刚丹酸、环烯醇等。见表1。

2.2 药物-疾病靶点预测 通过Gene Cards和OMIM数据库搜索直肠癌的靶点基因，输入 “Rectal cancer”，获取相关性评分大于5的基因共1 135个，将半夏与直肠癌的靶点基因进行映射，得到半夏-直肠癌的共同靶点共32个，并通过R语言绘制Venn图。见图1。记录共同靶点所对应的半夏关键化学成分，最终得到半夏-直肠癌的关键化学成分共10个，分别为24-乙基胆甾醇、卡维丁、黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、刚丹酸、松柏苷、10，13-二十碳二烯、（3S，6S）-3-（苄基）-6-（4-羟基苄基） 哌嗪-2，5-醌、β-D-核呋喃糖苷、黄嘌呤-9。半夏-直肠癌的共同靶点基因分别为孕激素受体（progesterone receptor，PGR）、雄激素受体 （androgen receptor，AR）、 雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、 前列腺素G/H合酶1（prostaglandin G/H synthase1，PTGS1）、 前 列 腺 素 G/H 合 酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、5-羟色胺受体3A （5-hydroxytryptamine receptor 3A，HTR3A）、维甲酸受体RXR-α （retinoic acid receptor RXR-α，RXRA）、beta-2肾上腺素受体（beta-2 adrenergic receptor，ADRB2）、钠依赖性血清素转运蛋白（sodiumdependent serotonin transporter，SLC6A4）、丝氨酸蛋白酶1 （serine protease 1，PRSS1）、 核转录因子-κB p65 （nuclearfactorkappa B p65，NF-κB p65/RELA）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine-protein kinase，AKT1）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、B细胞淋巴瘤－2（B cell lymphoma－2，BCL－2）、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（B cell lymphoma-2-associated X protein，BAX）、低聚果糖（fructooligosaccharide，FOS）、基质金属蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9，MMP9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3）、 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（cysteinyl aspartate specific proteinase 8，CASP8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，CASP9）、肿瘤蛋白63（tumor protein 63，TP63）、 缺氧诱导因子1-α （hypoxia-inducible factor 1-α，HIF1A）、G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1（G2/mitotic-specific cyclin B1，CCNB1）、细胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）、 胰岛素样生长因子2 （insulin-like growth factor 2，IGF2）、 细胞色素C （cytochrome C，CYCS）、 花生四烯酸12-脂加氧酶 （arachidonate 12-lipoxygenase，ALOX12）、活性蛋白-1（activator protein-1，AP-1/JUN）、尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinasetype plasminogen activator，PLAU）、 过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）。

表1 筛选后的半夏有效成分Tab.1 The active ingredients of Rhizoma pinelliae after screening

图1 半夏-直肠癌靶点基因匹配情况Fig.1 Rhizoma pinelliae-rectal cancer target gene matching

2.3 药物-关键化学成分-疾病网络的构建 通过Cytoscape3.7.2软件将药物-关键化学成分-疾病靶点基因网络进行可视化处理。见图2。

2.4 PPI网络分析 将半夏-直肠癌共有的32个靶点基因导入String数据库平台，筛选PPI关系评分＞0.7的蛋白关系，并绘制PPI网络图，其中蓝色连线代表基因共进化证据，红色连线代表基因融合证据，黄色连线代表文本挖掘证据等。见图3。该网络包括32个节点，91条边，其中PPI关系评分≥0.99的互作蛋白为JUNFOS、CASP8-CASP3、CCNA2-CCNB1、CASP9-CYCS、RXRA -PPARG、VEGFA -HIF1A、BCL2-CASP8、CASP3-CYCS、AKT1-CASP9、CASP8-CASP9、AKT1-ESR1，这些蛋白之间的相互作用在网络中非常重要。通过计算每个基因连接节点的数目，找出前15个PPI核心基因，为AKT1、JUN、CASP3、MMP9、VEGFA、AR、ESR1、PTGS2、CASP8、BAX、BCL-2、CYCS、FOS、PPARG、RELA，这些即为半夏治疗直肠癌的核心基因。见图3、4。

图2 半夏药物-关键化学成分与直肠癌作用靶点网络Fig.2 Target networks of Rhizoma pinelliae drugs-key chemical components and rectal cancer

图3 PPI关系网络Fig.3 PPI relationship network

图4 PPI核心基因Fig.4 PPI core genes

2.5 GO功能富集分析 结果显示共涉及66个功能，排名靠前的主要为核受体活性调节（包括6个靶点PGR、RXRA、AR、AHR、ESR1、PPARG）， 转录活性调节，配体直接调节序列特异性DNA结合 （共6个靶点PGR、RXRA、AR、AHR、ESR1、PPARG）， 类固醇激素受体活性（共5个靶点PGR、RXRA、AR、ESR1、PPARG），RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合（共6个靶点AR、FOS、AHR、JUN、ESR1、PPARG），DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性（共8个靶点PGR、AR、RELA、FOS、TP63、HIF1A、JUN、ESR1），半胱氨酸型内肽酶活性参与的凋亡过程 （共3个靶点CASP3、CASP9、CASP8），RNA聚合酶Ⅱ基础转录因子结合（共3个靶点AR、AHR、ESR1），转录共激活因子结合（共3个靶点RELA、AHR、ESR1），激活转录因子结合（共4个靶点RELA、FOS、JUN、PPARG）。见图5。说明半夏可以通过多种生物学调控过程发挥治疗直肠癌的作用。

图5 半夏-直肠癌关键靶点的GO生物学过程富集分析Fig.5 Enrichment analysis of GO biological process for Rhizoma pinelliae-rectal cancer key targets

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析结果显示，半夏治疗直肠癌的关键基因靶点主要富集的通路有104条，主要通路涉及乙肝通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染通路、小细胞肺癌通路、细胞凋亡通路、麻疹通路、人类免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus 1，HIV1）感染通路、大肠癌通路、多种凋亡通路、EB病毒感染通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、p53信号通路、铂剂耐药通路、白细胞介素-17（interleukin-17， IL-17）信号通路、前列腺癌通路等。见图6。

图6 半夏-直肠癌关键靶点的KEGG代谢通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway for Rhizoma pinelliae-rectal cancer key targets

3 讨论

本研究通过筛选半夏关键化学成分所对应的靶点基因，与直肠癌在人体所涉及的靶点基因进行映射，发现半夏中的关键化学成分可以通过多种靶点基因、多种信号通路对直肠癌的发生发展产生影响。半夏块茎含有挥发油，内含多种化学成分，本研究检索出与直肠癌相关的半夏有效化学成分共10种，包括卡维丁、黄芩素、黄芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇、刚丹酸、环烯醇等。卡维丁具有显著的抗肿瘤功效，此外还具有抗炎、调节免疫和抗病毒作用[16]。黄芩素亦具有抗肿瘤作用，同时还能够抗菌、抗病毒、抑制炎症反应、利胆、抗凝和抗血栓[17-18]。黄芩苷具有多方面的药理活性，能够减轻组织的缺血再灌注损伤，清除氧自由基，调节免疫和促进细胞凋亡等[19]。随着生物技术的发展，研究发现黄芩苷在抗肿瘤、抗HIV及治疗心脑血管疾病等方面都具有重要价值[20-21]。β-谷甾醇是一种植物甾醇，很多植物中均含有β-谷甾醇，可降低血液中胆固醇的含量，常用于治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化[22]。近年来研究发现β-谷甾醇还具有抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡的作用[23]。松柏苷具有抗氧化活性和抑菌活性，能够清除2，2-二苯基-1-苦肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基，还可用于抗肿瘤治疗[24]。 本研究通过PPI关系分析，得到15个PPI核心基因，为AKT1、JUN、CASP3、MMP9、VEGFA、AR、ESR1、PTGS2、CASP8、BAX、BCL-2、CYCS、FOS、PPARG、RELA，这些靶点基因即为半夏治疗直肠癌的核心基因。

进一步对靶标基因的功能和信号传导通路进行探索，GO功能富集分析显示，上述PPI核心基因可以通过影响核受体活性、转录因子活性、配体直接调节序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、DNA结合转录激活剂活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、半胱氨酸型内肽酶活性参与的凋亡过程、RNA聚合酶Ⅱ基础转录因子结合、转录共激活因子结合、激活转录因子结合等实现抗直肠癌的作用。KEGG通路富集分析结果显示，半夏治疗直肠癌的靶标基因主要富集的通路涉及乙肝通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染通路、小细胞肺癌通路、细胞凋亡通路、麻疹通路、HIV1感染通路、大肠癌通路、多种凋亡通路、EB病毒感染通路、TNF信号通路、p53信号通路、铂剂耐药通路、IL-17信号通路、前列腺癌通路等，这些通路都与直肠癌的形成和发展密切相关，且与大肠癌、小细胞肺癌、前列腺癌等癌症密切相关[25-27]。国外研究发现，通过激活p53信号通路及其下游信号通路，可以抑制肿瘤细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡，进而起到治疗肿瘤的作用[28-29]。研究证实，宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌等中均存在IL-17的高表达，与促进肿瘤发生发展相关，通过阻断IL-17信号通路可以改变肿瘤微环境，从而减少肿瘤的发生和恶性进展[30]。

综上所述，本研究应用网络药理学的手段对半夏的主要活性成分及靶点基因，以及与直肠癌作用通路的关系进行分析，阐述了半夏抗直肠癌多成分、多靶点、多通路的复杂作用机制，为更深入的实验研究奠定了基础，为研究其作用机制提供了新思路。