基于网络药理学探讨扶正解毒合剂治疗新型冠状病毒肺炎的机制

辽宁中医药大学附属医院 沈阳 110032

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）引起的急性呼吸道传染病，2019年12月于武汉爆发，临床表现主要为发热、干咳、乏力，胸片提示双肺浸润性病灶，少数患者为重症感染，表现为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克等[1-3]。国家卫健委于2020年1月21日将COVID-19纳入乙类传染病，采取甲类传染病的防控措施。目前已确认2019-nCoV病传播途径为呼吸道飞沫和密切接触，可以人传人，在潜伏期（1～14d）亦具有传染性，为防治带来巨大困难[4-5]。

关于本病的治疗，现代医学目前没有确认有效的治疗方法，利巴韦林与磷酸氯喹等药物在临床试用，但容易出现难以耐受的不良反应，目前的治疗手段仍以对症支持治疗为主[6-7]。武汉金银潭医院张定宇院长表示，COVID-19实为自限性疾病，通过生活调养，提升机体免疫力，亦能改善症状或者痊愈。上海华山医院感染科张文宏主任则表示，对抗COVID-19最有效的药物就是自身的免疫功能。

本病属中医“疫病”范畴，病程分为医学观察期和临床治疗期，并根据病情分为轻型（寒湿郁肺证及湿热蕴肺证）、普通型（湿毒郁肺证及寒湿阻肺证）、重型（疫毒闭肺证及气营两燔证）和危重型（内闭外脱证）[8-9]。目前的临床治疗及研究结果表明，中西医结合治疗COVID-19的疗效明显优于西药治疗，能够明显降低死亡率和轻转重症率[10-12]，故中医药治疗被纳入国家卫健委和国家中医药管理局共同发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案 （试行第五、六、七版）》[13-15]。

《素问遗篇·刺法论》：“正气存内，邪不可干。”对于COVID-19的防控，最主要治法还是提升人体的正气。扶正解毒合剂是辽宁中医药大学附属医院以国家级名中医张静生教授为核心的团队根据COVID-19发生发展特点拟定的有效方剂，可用于流感、轻型及重症肺炎的治疗，有效预防COVID-19发病，缓解病情，改善预后。本研究基于网络药理学对扶正解毒合剂的有效化学成分进行筛选，找出其治疗COVID-19的靶点基因及信号通路，进而探讨该合剂治疗COVID-19的分子作用机制，为进一步研究中医药作用机制提供科学依据。

1 资料和方法

1.1 扶正解毒合剂的中药化学成分筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP） （http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）检索扶正解毒合剂中8味中药的有效成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18为标准，分别对每味中药化合物的药物动力学进行筛选，其中OB是指药物经口服给药后被机体吸收进入血液循环的相对量和速率，DL反映化合物中的特定功能基团与已知药物的相似性，二者对中药化学成分活性的评估具有重要意义。

1.2 扶正解毒合剂与COVID-19的共同作用靶点筛选 利用TCMSP数据库搜索扶正解毒合剂关键化学成分的靶点信息，并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）查询与靶点相对应的人类基因名称，再与通过基因组注释数据库平台 （genome annotation database platform，Gene Cards）（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传（0nline Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https://www.omim.org/）筛选出的COVID-19的疾病靶点基因进行映射，得到药物-疾病靶点基因及与之对应的关键化学成分。

1.3 关键化学成分-靶点的网络可视化 将药物关键化学成分与疾病的共同靶点基因导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理，将关键化学成分与共同靶点基因的相互关系以网络图的形式进行呈现。在网络图中，关键化合物和靶点以节点表示，节点之间相互作用的关系以边来表示。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建 将扶正解毒合剂与COVID-19的共同靶点基因导入String数据库（https://string-db.org/Version 10.5），选择研究物种为人类（Homo sapiens），筛选评分＞0.7的蛋白关系并隐藏出现的游离蛋白，从而得到PPI网络。下载PPI网络图，并筛选排名前15的PPI网络核心基因。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）信号通路富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析 通过Bioconductor数据库（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查询药物-疾病共同靶点基因的基因ID。利用R语言安装Bioconductor平台相关安装包，设置P值=0.05，q值=0.05，进行GO富集分析和KEGG富集分析，输出结果并绘制barplot柱状图，并运用Cytoscape绘图软件构建靶点-信号通路网络图。

2 结果

2.1 扶正解毒合剂化学成分的筛选 利用TCMSP对扶正解毒合剂的8味中药中所含的化学成分进行检索，并通过OB≥30%、DL≥0.18标准进行筛选，共得到199个化学成分，其中白术7个、陈皮5个、防风18个、甘草92个、广藿香11个、黄芪20个、金银花23个、连翘23个。 见表1。

2.2 药物-疾病靶点预测 通过TCMSP查询扶正解毒合剂有效化合物的靶点信息，通过Uniprot进行基因ID的注释。通过Gene Cards和OMIM数据库搜索COVID-19的靶点基因，输入“New coronavirus”，获取相关疾病靶点基因共343个，将药物与疾病的靶点基因进行映射，得到药物-疾病共同靶点基因共51个。记录共同靶点所对应的扶正解毒合剂有效化合物，最终得到扶正解毒合剂和COVID-19的关键化学成分共126个，共同基因靶点共51个，分别为前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、PTGS1、二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）、核转录因子-κB p65（nuclear factor kappa B p65，NF-κB p65/RELA）、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，BCL-2）、B细胞淋巴瘤-2样蛋白1（B ceulympnoma-2 like protein 1， BCL-2L1）、B细胞淋巴瘤-2相关死亡启动子（B cell lymphoma-2 associated death promoter，BAD）、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（B cell lymphoma-2 associated X protein，BAX）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、MAPK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3）、CASP8、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、谷氨草酰乙转氨酶1（glutamic-oxaloacetic transaminase 1，GOT1）、 钙 调 蛋 白 1（camodulin 1，CALM1）、一氧化氮合酶2（nitric oxidesynthase 2，NOS2）、NOS3、 丝裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、MAPK14、环磷腺苷效应元件结合蛋白1（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein 1，CREB1）、磷脂酶A2组4A（phospholipase A2 group 4A，PLA2G4A）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-1β、IL-2、IL-1A、信号转导和转录激活子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、 血 红 素 加 氧 酶 1（hemeoxygenase1，HMOX1）、细胞间黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1）、 视 网 膜 母 细 胞 瘤 1（retinoblastoma 1，RB1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、低聚果糖 （fructooligosaccharide，FOS）、 蛋 白 激 酶 C alpha（protein kinase C alpha，PRKCA）、PRKCB、热休克蛋白A5（hot shock protein A5，HSPA5）、HSPB1、趋化因子配体2（chemokine ligand 2，CCL2）、趋化因子配体11（chemokine ligand 11，CXCL11）、CXCL2、丝氨 酸蛋白酶抑制蛋白E1（serine/cysteine proteinase inhibitor E1，SERPINE1）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP1）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、CXCL10、CD40配体（CD40 ligand，CD40LG）、干扰素调控因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）、白蛋白（albumin，ALB）、髓细胞白血病1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）、含缬酪肽蛋白 （valosin containing protein，VCP）。 见图1。

表1-1 扶正解毒合剂的有效化学成分Tab.1-1 Effective chemical components of Fuzheng Jiedu mixture

表1-2 扶正解毒合剂的有效化学成分Tab.1-2 Effective chemical components of Fuzheng Jiedu mixture

表1-3 扶正解毒合剂的有效化学成分Tab.1-3 Effective chemical components of Fuzheng Jiedu mixture

图1 扶正解毒合剂与COVID-19交叉基因韦恩图Fig.1 Venn diagram of coincidence targets between Fuzheng Jiedu mixture and COVID-19

2.3 药物关键化学成分-靶点网络构建 通过Cytoscape3.7.2软件对药物-关键化合物-疾病-靶点基因网络进行可视化处理。见图2。图中矩阵代表靶点，圆圈代表化合物，其中不同颜色代表化合物来源于不同的药物。其中药物活性成分以“degree”来表示，排名前10的关键化合物为槲皮素（quercetin，MOL00098，degree=36）、木犀草素（luteolin，MOL000006，degree=18）、山奈酚（kaempferol， MOL000422，degree=14）、汉黄芩素（wogonin，MOL000173，degree=14）、柚皮素 （naringenin，MOL004328，degree=12）、 川陈皮素（nobiletin，MOL005828，degree=11）、甘草查尔酮A（licochalconea，MOL000497，degree=11）、 鸢 尾 内 酯 （irisolidone，MOL005916，degree=10）、 异 鼠 李 素 （isorhamnetin，MOL000354，degree=8）、 芒柄花黄素（formononetin，MOL000392，degree=8）。 排名前10的靶点有PTGS2、CALM1、NOS2、PPARG、PTGS1、MAPK14、DPP4、RELA、BCL2、CASP3。

2.4 PPI网络分析 将药物-疾病共有的51个靶点基因导入String数据库，研究物种选择人类（Homo sapiens），获取蛋白质相互作用关系，筛选评分＞0.7的蛋白关系，并绘制PPI网络图。见图3。图中以蓝色连线代表基因共进化证据，红色连线代表基因融合证据，黄色连线代表文本挖掘证据等。该网络包括51个节点，313条边，其中评分≥0.995的互作蛋白为BADBCL2L1、RB1-CDK4、CASP8-CASP3、CASP8-BCL2L1、BCL2L1-BAX、IL1B-IL1A、BCL2-CASP8、MCL1-BAX、SOD1-CAT、IL6-IL4。这些蛋白之间的相互作用在网络中非常重要，通过计算每个基因连接节点的数目，找出前15个PPI核心基因，分别为IL-6、MAPK1、MAPK8、CASP3、IL-1B、RELA、MAPK3、PTGS2、MAPK1 4、CCL2、FOS、IL-2、STAT1、EGFR、ICAM1，这些即为扶正解毒合剂治疗COVID-19的核心基因。见图3、4。

图2 扶正解毒合剂关键化学成分-靶点网络图Fig.2 The key ingredients-target network diagram of Fuzheng Jiedu mixture

2.5 GO功能富集分析 GO主要包括生物过程（biological process，BP）、 细胞组成 （cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3部分。 主要富集的BP包括脂多糖应答（response to lipopolysaccharide）、细菌起源分子应答（response to molecule of bacterial origin）、 金属离子应答（response to metal ion）、细胞对生物刺激的反应（cellular response to biotic stimulus）等。见图5。富集的CC包括膜筏（membrane raft）、膜 微区 （membrane microdomain）、膜 区（membrane region）等。见图6。富集的MF包括细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、蛋白磷酸酶结合 （protein phosphatase binding）等。 见图7。

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析结果显示，扶正解毒合剂治疗COVID-19的关键靶点蛋白主要富集的信号通路包括晚期糖基化终产物及其受体（advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE） 信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、IL-17信号通路等。见图8。

2.7 靶点-通路网络构建 应用Cytoscape软件将得到的通路和靶点信息绘制成网络图，根据连接节点数目设定degree，形状越大表示富集越显著，网络中的核 心 靶 点 为 IL-6、RELA、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、STAT1、CASP3等。 见图9。

图3 PPI网络Fig.3 PPI network

图4 PPI核心基因Fig.4 PPI core genes

图5 扶正解毒合剂主要作用靶点BP气泡图Fig.5 The bubble chart of biological process of main targets of Fuzheng Jiedu mixture

图6 扶正解毒合剂主要作用靶点CC气泡图Fig.6 The bubble chart of cellular component of main targets of Fuzheng Jiedu mixture

图7 扶正解毒合剂主要作用靶点MF气泡图Fig.7 The bubble chart of molecular function of main targets of Fuzheng Jiedu mixture

图9 靶点-通路网络Fig.9 Target-pathway network

3 讨论

冠状病毒广泛存在于人类和其他哺乳动物中，包含4个病毒属，大多数冠状病毒感染较轻。2019-nCoV是一种新出现的β冠状病毒，Zhuo等[16]发现2019-nCoV病毒的基因序列与重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndromes，SARS）病毒的相似度高达75%。且有研究发现，蝙蝠是该病毒的来源宿主，因为该病毒与一组蝙蝠来源的SARS样冠状病毒的亲缘性最高，核苷酸相似性高达89.1%[17]。随后，研究人员发现穿山甲的冠状病毒基因组与2019-nCoV基因组相似率高达92.4%，揭示穿山甲可能是2019-nCoV的中间宿主[18]。

而2019-nCoV究竟来自何方，何时会发生突变，是科学界所关心的问题。病毒突变速度快，人类对病毒的研究永远跟随其后，而中医早在千年以前就有过抗疫经历，根据天人合一的思想，以不变应万变，通过提高机体免疫力的方式来应对外界各种变化，在战略上做到先发制人，故中医药在对2019-nCoV的抗击过程中展现出明显优势。

本研究提示，扶正解毒合剂所含的槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、川陈皮素、甘草查尔酮A、鸢尾内酯、异鼠李素、芒柄花黄素等化合物在与靶点基因的匹配中，具有较高的自由度。槲皮素又名栎精，具有较好的祛痰、止咳功效，并具有一定平喘作用，多用于慢性支气管炎的治疗；同时还具有抗血小板聚集、抗肿瘤、防止心肌损伤等作用[19]。木犀草素是天然黄酮类化合物，具有较好的镇咳和祛痰功效，对于支气管哮喘、慢性咽炎等疾病的局部炎症浸润具有较强的抗炎作用。木犀草素与炎症细胞因子TNF-α、IL-6等的κ产生密切相关，且与NF-κB介导的基因表达有关，此外还具有抗肿瘤、抗过敏、抗肺纤维化和舒张血管等作用[20-21]。山奈酚属于黄酮类化合物，可通过抑制炎症因子的表达来达到抗炎效果，同时可通过抑制IL-6、TNF-α的表达，从而降低小鼠肺损伤程度，且具有抗癌、抗动脉粥样硬化、增强胰岛素敏感性等功效[22]，其与芒柄黄花素均可通过降低肌酸激酶（creatine kinase，CK）、 乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase，LDH）活性来保护受损心肌细胞[23]。柚皮素是柚皮甙的甙元，具有抗炎、抗纤维化、抗肿瘤和抗病毒作用，研究表明其可通过降低IL-6、TNF-α含量来显著降低小鼠肺泡灌洗液中的白细胞计数和炎症因子含量；同时还可提高SOD活性，缓解小鼠急性肺损伤[24]。异鼠李素为黄酮类化合物，具有较好的氧自由基清除作用，同时具有抗心肌缺血、降低胆固醇、保护心血管等生物学效应，研究表示异鼠李素可能通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）信号通路发挥细胞保护作用[25]。

本研究中的关键靶点蛋白有IL-2、IL-6、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、CASP3、RELA、STAT1 等 。IL家族功能复杂，在免疫细胞的成熟、增殖、免疫调节等过程中发挥重要作用[26]。IL-6能够刺激B细胞及T细胞增殖和分泌抗体，还能活化细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）[27]。 MAPK与细胞增殖、免疫调控相关，宿主细胞可通过抑制MAPK来抑制病毒的活性[28]。RELA与中性粒细胞的凋亡密切相关，且与哮喘严重性有关[29]。CASP3与细胞凋亡的执行阶段密切相关，同时参与淀粉样β4A前体蛋白的裂解[30]。STAT1与细胞因子信号转导相关，在炎症反应中发挥重要作用，可促进炎性因子的释放，诱发炎症反应[31]。

GO富集分析结果显示，BP主要包括脂多糖应答、细菌起源分子应答等。脂多糖通过细胞膜中的TLR4来表现作用，后者与炎性细胞因子的表现相关，在免疫应答中起着重要作用，可以上调炎性因子，加重肺损伤[32]。KEGG富集分析所涉及的通路有AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路。RAGE在炎症反应中担任促炎性介质的角色，而RAGE的配体中，AGEs在促炎症反应中起到非常重要的作用[33]。TNF信号通路对促进细胞生长、分化、凋亡及诱发炎症具有较强的效应[34]。IL-17信号通路对宿主防御功能十分重要，与自身免疫性疾病及癌症的发病密切相关[35]。

综上所述，本研究阐述了扶正解毒合剂治疗COVID-19的关键化学成分、作用靶点及作用信号通路，结果提示扶正解毒合剂可通过抑制炎症反应、提高机体免疫能力等途径对COVID-19起到治疗作用。探讨扶正解毒合剂治疗COVID-19多成分、多靶点、多通路的复杂作用机制，为未来的实验研究及更广泛的临床应用提供了科学依据。