自发性高血压大鼠发病机制及与血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子关系的实验研究

刘长召，王 玲，卢新林，陈文江

高血压是心血管疾病的重要危险因素之一，50%～60%的脑卒中和40%～50%的心肌梗死都与高血压有关，高血压患病率呈明显上升趋势，目前，我国15岁以上人口的高血压患病率达24%，估算有2.66亿高血压病人。而值得重视的是，随着人口老龄化的加速，我国老年高血压的患病率已经大幅增加，在60～69岁人群中，高血压患病率超过40%，而且随着年龄增加患病率逐渐上升，在75岁以上人群中患病率已经超过60%[1-2]。由于老年人的绝对人数和占人口的构成比不断增长，影响老年人健康长寿和生命质量的主要疾病中，高血压是一个重要危险因素。高血压病人往往具有病程长、并发症多等特点，而且随着病程发展，会出现心、脑、肾等靶器官损害，其中，以心脏损害最为严重，主要表现为左心室心肌肥厚、室间隔肥大、心脏纤维化、心室重构、心室舒张功能障碍及明显的氧化应激损伤等，晚期往往导致心力衰竭[3-5]。

随着高血压的发展，靶器官心脏损害越来越明显，其发生机制尚不完全明确，目前多认为是多种因素共同导致。其中，心脏的纤维化在靶器官损害中扮演着重要角色，而心脏的纤维化主要认为与多种纤维化因子的紊乱有关，且心脏纤维化与纤维化因子互为因果，互相影响[6-8]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)为心脏较为重要的纤维化因子，现被证实参与心肌梗死后心脏的纤维化过程[9-11]。本研究拟采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)模型，研究高血压靶器官心脏的损害机制，以期为高血压治疗提供基础数据和研究方向。

1 材料与方法

1.1 动物模型与标本采集 20只雄性SHR(6月龄)，分为两组：SHR模型组及给予氨氯地平(购于上海通用药业公司)10 mg/(kg·d)喂养的模型对照组(氨氯地平模对照组)，每组10只；另取10只Wistar-Kyoto rats(WKY)作为WKY正常对照组，皆由广东省实验动物中心提供。将3组大鼠喂养12周，SHR模型组与WKY正常对照组大鼠给予正常标准饲料喂养，而氨氯地平模型对照组SHR则在标准饲料中混入氨氯地平进行喂养。实验周期为12周，每周测1次大鼠血压(用鼠尾静脉血压仪进行测量)和体重。于实验结束时，先采集各组大鼠右心室血液2 mL，然后获取大鼠心脏组织。

1.2 试剂与仪器 VEGF和FGF ELISA试剂盒由深圳柏万森生物有限公司提供，核酸蛋白测量仪(Biophotometer，Eppendorf公司)，PCR扩增仪(Eppendorf公司，德国)，LightCycler480II全自动荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)，全自动酶标议(BIO-RAD，美国)，稳流稳压电泳仪(BIO-RAD，美国)，垂直电泳槽(BIO-RAD，美国)，电转膜仪(BIO-RAD，美国)，逆转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)，PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司 )，TRIZOL试剂(Invitrogen，美国)，PCR引物(英潍捷基上海贸易有限公司合成)，VEGF和FGF抗体(武汉博士德生物试剂公司)，Western及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)，PMSF(碧云天生物技术研究所)，增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.3 ELISA检测血浆VEGF和FGF 将所获取的各组大鼠全血进行离心(3 000 r/min，24 ℃，10 min)分离血浆，取各组大鼠血浆，按照ELISA试剂盒说明书对血浆VEGF和FGF进行检测，观察其变化情况。具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4 qRT-PCR提取大鼠心脏组织RNA 首先应用TRIZOL按照说明书提取所获取各组大鼠心脏组织的RNA，最后所得RNA吸光度值A260/A280在1.7～2.1为合格。按照逆转录试剂盒说明书将所提取RNA进行逆转录，然后将逆转录所获取的cDNA模板按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行荧光定量，其中，预变性30 s，95 ℃；扩增、延伸15 s，95 ℃；退火30 s，60 ℃，共40个循环，以β-actin作为内参。VEGF引物：上游TCCAATTGAGACCCTGGTGGA，下游AAGGCTCACAGTGAACGCTCC；FGF引物：上游AACACTTACCGGTCACGGAA，下游CAGGGTGGCTAGGCTACTACT；β-actin引物，上游GCAGGAGTACGATGAGTCCG，下游ACGCAGCTCAGTAACAGTCC。本研究采用2-ΔCt相对定量方法进行数据分析：ΔCt(实验组)=Ct(实验组目标基因)-Ct(实验组内参基因)；ΔCt(对照组)=Ct(对照组目标基因)-Ct(对照组内参)。

1.5 用Western Blot检测大鼠心脏组织VEGF和FGF蛋白表达 将所获取的各组大鼠心脏组织左心室进行分离，提取蛋白质，采用BCA法测量蛋白浓度，继而进行蛋白电泳、转膜、VEGF和FGF一抗孵育、二抗孵育、杂交、显影、曝光。VEGF稀释比例1∶1 000，FGF稀释比例1∶1 000，内参选用β-actin(稀释比例1∶1 000)。结果分析用Image J图像分析软件计算条带灰度值，最后结果为目的条带灰度值/内参条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠血压情况 3组大鼠在实验期间生长良好，SHR模型组死亡1只，另外两组未见死亡。 SHR在进行氨氯地平喂养后，血压可以明显下降，与SHR模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而在12周时与WKY正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明氨氯地平可有效降低SHR血压。详见表1。

表1 各组大鼠不同时间收缩压情况比较(±s) 单位：mmHg

2.2 各组大鼠血浆VEGF和FGF表达情况 3组大鼠血浆ELISA检测结果发现，SHR模型组血浆VEGF和FGF的表达较WKY正常对照组和氨氯地平模型对照组升高(P<0.05)，氨氯地平模型对照组血浆VEGF和FGF的表达明显降低(P<0.05)，然而仍然高于WKY正常对照组(P<0.05)。详见表2。说明VEGF和FGF与SHR高血压的发生有关。

表2 各组大鼠血浆VEGF和FGF的ELISA检测情况比较(±s) 单位：ng/L

2.3 各组大鼠心脏组织VEGF和FGF mRNA表达情况 提取3组大鼠心脏组织RNA，进行逆转录和荧光定量检测，发现SHR模型组心脏组织VEGF和FGFmRNA表达较氨氯地平模型对照组与WKY正常对照组明显增加(P<0.05)，而氨氯地平模型对照组则与WKY正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1。说明VEGF和FGF在SHR大鼠的心脏靶器官损害中起着重要作用，且随着药物的应用，高血压进程不再恶化，基因的表达差异无统计学意义。

与SHR模型组比较，＊P<0.05。

2.4 各组大鼠心脏组织VEGF和FGF 蛋白表达情况 SHR模型组VEGF和FGF蛋白表达较氨氯地平模型对照组与WKY正常对照组的表达明显增加(P<0.05)，而氨氯地平模型对照组则与WKY正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2、图3。说明SHR高血压的发生发展可能与VEGF和FGF有关。

图2 各组大鼠心脏组织VEGF和FGF蛋白表达情况(电泳图)(A为 WKY正常对照组；B为 SHR模型组；C为氨氯地平模型对照组)

与SHR模型组比较，＊P<0.05。

3 讨 论

目前我国老年高血压病人已达8 346万人，而且老年高血压患病人数呈持续增加趋势，随着年龄增加患病率逐渐上升，75岁以上人群患病率已经超过60%；老年高血压发病率在男女性别间不同，60岁以上男性发病率为41.6%，而女性为38.4%。由于老年人的绝对人数和占人口的构成比在不断增长，高血压已经严重影响老年人的健康和生命质量，成为严重危害健康的心血管疾病[12-13]。高血压发病机制目前主要认为与遗传因素(主要有单基因遗传模式和多基因遗传模式，其中多基因遗传模式是主要的一种，而单基因遗传模式只存在于少数高血压病人中)、大动脉弹性减退(动脉发生粥样硬化和纤维性硬化)、周围血管阻力升高、肾脏排钠能力下降、交感神经系统α受体功能亢进、血小板功能减退、压力感受器功能下降等机制有关[3，14]。高血压对人体的损伤主要通过靶器官心、脑、肾、眼底等来实现，尤其对心脏的损害较为常见，往往导致心室肥厚、心肌纤维化等，而目前研究表明高血压病理生理过程与VEGF、FGF等因子密切相关。

VEGF也称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF) 或者促血管因子(vasculotropin，VAS)，其作用是能够特异性地直接作用于血管内皮细胞，可以刺激血管内皮细胞增殖、迁徙，甚至改变其基因表达，是促进血管生成的重要因子[9，15-18]。有研究证实原发性高血压病人的血浆VEGF水平正较常人明显升高[8，19]；另有研究证实VEGF随着原发性高血压的发展而在心肌细胞中的表达逐渐增强[20-21]。FGF是一种能调节细胞增殖、分化的多肽家族，在体内的许多组织和器官内均有分布，其作用主要是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，但是不能使平滑肌细胞游走；同时能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞[7，10，14]。有研究证实FGF与高血压的发生发展有密切关系，并导致心室肥厚[2，11，18]。

本研究通过SHR动物模型，以WKY作为对照，并采用氨氯地平进行治疗，研究高血压靶器官心脏的损害机制，通过对VEGF和FGF在3组大鼠血浆水平和心脏组织基因和蛋白水平的检测发现，SHR中VEGF和FGF无论在血浆蛋白还基因和组织蛋白水平较氨氯地平模型对照组与WKY正常对照组的表达明显增加，而氨氯地平模型对照组则与WKY正常对照组比较差异无统计学意义，说明VEGF和FGF参与了SHR靶器官心脏损害，可能在高血压的发展中起着重要作用。

本研究通过SHR模型探讨VEGF和FGF对高血压发病机制的影响，在动物模型和分子生物学层面进行探讨，结果表明VEGF和FGF在SHR表达明显升高，经过氨氯地平处理后会相应下降，说明VEGF和FGF与高血压发病机制密切相关，可为高血压的靶向及基因治疗等提供新思路和新方法。由于本研究是动物模型研究，有可能导致结果与临床有差异，且本研究只是一个初步研究，对于VEGF和FGF的具体机制未进行信号通路阻断及上下游基因探讨，有待继续深入研究以探明VEGF和FGF在高血压中的确切作用机制。