HPLC法同时测定赤水晒醋中9种有机酸

卢叶 张季 向丽萍 王兰兰 骆书娜 王奥

摘 要：本研究以赤水晒醋作为供试品，建立了一种以HPLC法检测赤水晒醋中9种有机酸的分析方法。采用Waters XSelect HSS T3色谱柱，以20 mmol·L-1 NaH2PO4溶液为流动相，流速0.7 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长为215 nm，外标法定量。结果表明，赤水晒醋样品中9种有机酸在线性范围内均能达到很好的分离，相关系数≥0.999，建立的赤水晒醋有机酸的检测方法灵敏、准确，重复性好。

关键词：赤水晒醋;有机酸;高效液相色谱法

Abstract：In this study， Chishui sun vinegar was used as the test sample， 9 organic acids in Chishui sun vinegar was established by HPLC. In HPLC method， organic acids was separated on a Waters XSelect HSS T3 chromatographic column with 20 mmol·L-1 NaH2PO4 solution as the mobile phase with flow rate of 0.7 mL·min-1， column temperature was maintained at 25 ℃ and the wave length was detected at 215 nm.External standard method for quantification. The results of HPLC showed that 9 organic acids displayed good linearity. The correlation coefficients （R2） of 9 organic acids were more than 0.999， the established detection method for organic acid in Chishui sun vinegar is sensitive， accurate and reproducible.

Key words：Chishui sun vinegar; Organic acids; HPLC

中图分类号：O657.72

赤水晒醋，即在贵州赤水以传统的工艺生产，采用固体发酵繁殖产生天然醋酸菌，醋坯和成品醋均经日光曝晒，故称“晒醋”，2015年曾获“国家地理标志保护产品”[1]。目前针对贵州特色食品赤水晒醋仅有关于香气成分[2]以及菌株和微生物[3-4]的分析研究，鲜有对其中有机酸类物质的研究报道。醋中含有丰富的有机酸，分为挥发酸和不挥发酸，其含量决定了醋滋味的柔和程度，挥发酸含量高的刺激性强，不挥发酸含量高的食醋刺激性小，酸味柔和[5]。有机酸类成分是赤水晒醋闻之酸香扑鼻、沁人肺腑，食之酸甜可口，浓香味美，回味绵长的特别滋味的主要来源，故有必要对晒醋中有机酸类成分进行检测。文献报道有机酸类成分的检测多使用高效液相色谱法[6-9]、分光光度法[10]、离子色谱法[11]等。因此本研究以赤水晒醋为对象，建立并且优化了一种HPLC对其中的有机酸类成分同时测定的方法，为赤水晒醋进一步的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准物质：琥珀酸、苹果酸、酒石酸、醋酸、草酸、乳酸、焦谷氨酸，均购自Dr Ehrenstorfer GmbH公司;柠檬酸，购自美国Sigma-Aldricb公司;丙酮酸，购自上海安谱实验科技股份有限公司，纯度≥98%。晒醋样品，均为各大超市采购，见表1;磷酸二氢钠、磷酸，均为分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司;实验用水为Milli-Q超纯水;0.22 μm尼龙有机滤膜，购自天津市津腾试验设备有限公司。

1.2 仪器与設备

Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、Milli-Q Reference超纯水发生器（美国Millipore公司）、AL204-IC万分之一天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别称取各标准品适量，用水溶解定容配制标准储备液，其浓度分别为0.821 2 mg·mL-1（草酸）、2.006 0 mg·mL-1（酒石酸）、0.869 2 mg·mL-1（丙酮酸）、2.002 8 mg·mL-1（苹果酸）、2.000 0 mg·mL-1（乳酸）、2.066 4 mg·mL-1（乙酸）、2.207 6 mg·mL-1（柠檬酸）、2.000 0 mg·mL-1（焦谷氨酸）、4.007 2 mg·mL-1（琥珀酸）。于4 ℃冰箱中保存，使用时根据需要用流动相逐级稀释成适当浓度的标准混合工作溶液。

1.3.2 供试品溶液制备

移取混合均匀后的晒醋样品5 mL于50 mL容量瓶中，用去离子水定容，充分颠倒混匀，用0.22 μm的滤膜过滤弃初滤液，取续滤液供HPLC分析用。

1.3.3 检测条件

Agilent 1260高效液相色谱仪，流动相：20 mmol·L-1 NaH2PO4溶液（用0.1%磷酸调pH，使pH=2.7）;流速：0.7 mL·min-1;进样体积：10 μL;柱温：30℃;紫外检测器波长：215 nm;色谱柱：Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6 mm×250 mm）;等度洗脱（0～25 min）。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

2.1.1 流动相pH值考察

为使有机酸尽可能以分子形式存在，一般使用酸性流动相来抑制有机酸的解离[12]。高海燕等[13]在以磷酸氢二钾为缓冲盐，实现了11种有机酸（纯草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸）的良好分离，饶静等[14]以磷酸氢二铵作为流动相检测苹果醋中有机酸。本试验参考上述文献的条件，比较了K2HPO4、（NH4）2HPO4以及NaH2PO4对有机酸分离效果的影响。首先用20 mmol·L-1的K2HPO4溶液调pH值来考察，当pH值为2.30时，酒石酸和丙酮酸的分离度不够理想;当pH值为2.90时，乙酸和柠檬酸不能完全分开;当pH值为2.70时，酒石酸、丙酮酸有了很好的分离度，乙酸与柠檬酸分离度有了一定的改善。因此选择pH为2.70作为最适实验条件。鉴于乙酸与柠檬酸的分离度并未完全分离开，实际又进一步用20 mmol·L-1的NaH2PO4溶液和20 mmol·L-1的（NH4）2HPO4溶液调pH为2.70进行考察，发现当用20 mmol·L-1的NaH2PO4溶液调pH时，乙酸和柠檬酸以及酒石酸、丙酮酸均能得到很好的分离。

2.1.2 样品前处理条件考察

本研究考察了样品前处理稀释2、5、10、50倍来进行提取，结果显示样品稀释2倍和5倍时部分有机酸峰不能分开，当样品稀释50倍部分峰低于检测限，所以选择将样品稀释10倍进行处理。

2.1.3 色谱条件考察

试验分别将0.5、0.7、0.8、0.9 mL·min-1的测定流速进行了对比，结果发现只有在0.7 mL·min-1的流速下峰型未见拖尾现象，并且能达到很好的分离度。

同时还对Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6×250 mm）色谱柱、Inertsil RODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱以及Agela Technologies Odyssil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行了摸索，发现Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6×250 mm）色谱柱对有机酸的分离有更好的效果。

2.2 系统适用性试验

对9种有机酸在215 nm光谱下进行检测，标准品与供试品均在此波长下有较强的吸收，标准品、样品以及空白溶液的色谱图见图1所示。

2.3 方法学验证

2.3.1 检出限、定量限和线性方程

分别精密吸取各标准溶液以表2中的线性范围，按1.3.3色谱条件进行检测，精密量取已知浓度的各标准溶液以表2中的线性范围依次稀释制成系列浓度由高到低的溶液，进样10 μL，测得各有机酸的检测限（Limit of detection，LOD，S/N=3）和定量限（Limit of quantitation，LQD，S/N=10）分别以对照品的浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，得到回归方程，9种有机酸在表2所示的线性范围内均有良好的线性关系，其相关系数R2均大于0.999。

2.3.2 精密度、稳定性和重复性试验

取高、中、低3种浓度的有机酸对照品溶液，在1.3.3色谱条件下连续进样6次，记录9种有机酸的色谱峰峰面积并计算峰面积的RSD<3%，表明日内精密度良好。连续3天测试，计算峰面积的RSD<3%，表明日间精密度良好。

取同一个晒醋样品6份，精密称定，按“供试品溶液制备”项下操作，在1.3.3色谱条件下进样测定，计算每个有机酸色谱峰的峰面积及其相对标准偏差 RSD，结果如表3所示，表明方法重复性良好。

取晒醋样品约5 mL，精密称定，按“供试品溶液制备”项下操作，在1.3.3色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24、48 h和72 h测定，记录9种有机酸的色谱峰的峰面积，RSD良好均符合要求，结果表明供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.3.3 加标回收率试验

取已知含量的晒醋样品，精密称定，分别加入一定含量的对照品，按“供试品溶液制备”项下操作，在1.3.3色谱条件下进样测定并计算加样回收率，平均加标回收率如表4所示。

2.4 晒醋样品测定

分别取市场收集的晒醋样品约5 mL，精密称定，按“供试品溶液制备”项下操作，制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，计算9种有机酸在晒醋中的含量，结果见表5。

3 讨论

本研究通过对供试品溶液的前处理条件和色谱条件进行优化，建立了一种能够同时测定赤水晒醋中9种有机酸的高效液相色谱方法。结果显示该方法有很好的线性范围、精密度、重复性、稳定性、加标回收率，该方法可有效去除杂质干扰，且具有快速、便捷、准确性高等优点，可用于晒醋类产品中有机酸的准确测定。

采用本文所建立的方法对赤水晒醋样品有机酸进行的含量分析可以看出，除了乙酸挥发酸以外，不挥发酸琥珀酸和乳酸的含量最高，其中琥珀酸为酵母菌发酵的代谢产物，具有鲜酸爽口的滋味[15]。乳酸存在能够缓和发酵食醋中乙酸带来的强烈刺激性，从而赋予食醋酸味柔和的特点，赤水晒醋中不挥发酸的总含量要高于挥发酸的总含量，这与其酸味柔和的滋味特点相符，也对赤水晒醋滋味的进一步研究提供参考。

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基金项目：贵州省质量技术监督局科技计划项目“贵州地理标志产品赤水晒醋品质特征研究”（编号：2017kj010）;遵义市优秀青年科技创新人才培养项目“贵州省特色食品质量与安全研究及应用”（编号：遵优青科[2018]

4号）;贵州省科技计划课题“贵州汇川城郊现代农业科技示范园区”（编号：黔科合平台人才[2016]5243-02号）。

作者简介：卢 叶（1991—），女，硕士;研究方向为食品检测技术。

通信作者：王 奥（1986—），男，博士，高级工程师;研究方向为食品质量与安全风险。