长链非编码RNA FEZF1-AS1在喉癌中的表达及意义*

曲丹菊, 张超, 苏吉利

河南科技大学第一附属医院(河南科技大学临床医学院)耳鼻咽喉科(河南洛阳 471000)

喉癌(laryngeal cancer，LC)是临床上头颈部常见的恶性肿瘤，占全身肿瘤的2.1%，喉癌原发部位可以分为：声门型、声门上型、声门下型，其中以声门型占60%[1-2]。喉癌，大约98%为鳞状细胞癌，其他腺癌、恶性淋巴瘤、基底细胞癌、淋巴肉瘤等临床上少见。早期喉癌患者，术后多能保留发声和吞咽功能，但喉癌临床表现具有隐蔽性，导致大部分患者发现病情时，喉癌已处于中晚期，中晚期患者治疗多采用全喉切除加放疗，患者术后发音、呼吸及进食功能皆受到严重影响[3-4]。目前喉癌具体病因尚不清楚，可能与环境因素、吸烟、饮酒等不良生活等相关。近年来发现Lnc RNA在癌症中作用越来越被重视，Lnc RNA具有很多生物学功能。Lnc RNA FEZ家族锌指1反义RNA(Lnc RNA FEZF1-AS1)是新发现的Lnc RNA，FEZF1-AS1也与肿瘤发生发展相关，研究发现FEZF1-AS1能够促进大肠癌细胞迁移和侵袭[5]。也有报道显示[6]FEZF1-AS1在胰腺癌、大肠癌等恶性肿瘤中高表达，并且与不良预后相关。但FEZF1-AS1如何影响喉癌目前尚少有文献报道，本研究采用实时定量法测定喉癌组织中FEZF1-AS1水平，并分析与喉癌临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2016年1月至2018年1月术前未经治疗的喉癌患者78例组织标本，其中男65例，女13例，年龄36～72岁，平均(54.28±13.42)岁，纳入标准：(1)所有患者经病理诊断确诊为喉癌；(2)患者临床资料完整，能够接受术后随访。排除标准：(1)并发其他恶性肿瘤患者；(2)具有精神异常患者；(3)因经济等原因，停止后续治疗患者。同期取喉癌旁正常黏膜组织78例作为对照组。将标本分为两部分，一部分液氮冷冻后，保存于-80℃冰箱，一部分标本置于10%中性甲醛固定24 h，将组织取出、石蜡包埋，然后用苏木精-伊红染色。所有标本送于病理科，均由两位副主任医生确定喉癌组织为鳞状细胞癌，喉癌旁黏膜组织为正常组织。本研究经本院道德伦理委员会批准通过，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(DP431)，天根生化科技有限公司；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR® Green Quantitative RT-qPCR Kit(QR0100)，日本TaKaRa生物公司；C1000 TouchTMPCR仪、CFX96荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 临床资料收集 根据国际抗癌联盟(UICC)协会关于喉癌TNM分期标准(2002)确定。原发部位：声门上型24例，声门型42例，声门下型12例；临床分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ期28例，Ⅳ期20例；病理学分级：鳞状细胞癌G1级40例，G2级26例，G3级12例；病理证实颈部有无淋巴结转移，转移组54例，无转移组24例。

1.4 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测FEZF1-AS1表达水平 从超低温冰箱取出喉癌患者癌症组织及癌旁组织样品，在液氮中研磨，RNA提取试剂盒按照操作步骤提取总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit反转录得cDNA。用qRT-PCR仪检测FEZF1-AS1表达水平，分别采用内参和FEZF1-AS1引物，以cDNA模板进行特异性扩增，所有实验均重复3次，每次实验时同时检测样本的内参基因和FEZF1-AS1的值，取3次结果的平均值为实验结果，qRT-PCR程序设定为94℃预热3 min，94℃ 30 s，56℃ 35 s，72℃ 25 s，共40个循环。总反应体系(20.0 μL)：2×SYBR Green Taq Ready Mix, 10.0 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA模板(25 ng/μL)2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。引物由上海生工合成。引物见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 随访 随访时间为3～36个月，随访截止时间为2019年1月，死亡患者以死亡日期作为随访截止时间，随访方式为入户、电话随访，门诊检查，随访内容为患者生存情况等。

1.6 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件，计数资料以例(%)表示，行2检验；计量资料以平均数±标准差的形式表示，两组间行LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FEZF1-AS1在喉癌组织和喉癌旁黏膜组织表达水平 与喉癌旁黏膜组织相比，喉癌组织FEZF1-AS1表达水平较高(P<0.05)，见表2。

表2 FEZF1 － AS1 在喉癌组织和喉癌旁黏膜组织表达水平

2.2 FEZF1-AS1表达水平与喉癌临床病理参数的关系 以FEZF1-AS1表达水平平均数为界，将喉癌患者分为高表达组60例和低表达组18例。分析显示，FEZF1-AS1表达水平与性别、年龄、喉癌原发部位、病理学分级无关(P>0.05)，与临床分期、T分级、淋巴结转移有关(P<0.05)，见表3。

表3 FEZF1-AS1表达水平与喉癌临床病理参数的关系 例(%)

2.3 FEZF1-AS1表达水平与喉癌患者生存率的关系 FEZF1-AS1高表达喉癌患者中位生存时间为13.60个月，显著短于FEZF1-AS1低表达患者中位生存时间(23.44个月)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.4 影响喉癌患者预后的危险因素分析 单因素分析表明，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、T分级T3～T4期及FEZF1-AS1高表达是喉癌患者不良预后的危险因素。多因素分析表明，有淋巴结转移、FEZF1-AS1高表达是喉癌患者不良预后的独立危险因素(HR=1.589，95%CI为1.362～1.854；HR=2.375，95%CI为1.367～4.127，P<0.05)，见表4。

3 讨论

喉癌是相对侵袭较高的恶性肿瘤，占每年新发肿瘤的2.4%[7]。喉癌在临床上主要表现为喉鳞状细胞癌[8]。目前，尽管医学水平不断提高，但晚期喉癌患者术后生存率仍然较低，因此，喉癌的早期诊断显得尤为重要[9]。为提高喉癌患者预后生活质量，寻找新型预后监测指标迫在眉睫。

FEZF1-AS1位于染色体7号上，长度为大约为2 653 bp，基因组结构分析显示，它包含3个剪接变体和7个外显子。Chen等[5]首先报道FEZF1-AS1在人原发性大肠癌中上调，并与大肠癌转移和

图1 FEZF1-AS1表达水平与喉癌患者生存率的关系

表4 COX回归分析影响喉癌患者预后的危险因素

不良预后有关，细胞实验发现FEZF1-AS1表达影响大肠癌细胞的增殖、迁移。Cheng[10]通过定量实时PCR证实，FEZF1-AS1在鼻咽癌组织中表达水平显著增加，与鼻咽癌患者远处转移密切相关，敲除FEZF1-AS1基因，可诱导癌细胞生长周期停滞在G0/G1期。食管癌是全球范围内具有高发病率，高病死率的致死性癌症之一。Yang等[11]在食管癌研究中发现，FEZF1-AS1在食管癌组织和细胞中表达水平均显著上调，FEZF1-AS1低表达可抑制食管癌细胞的迁移和侵袭，而FEZF1-AS1过表达则加速食管癌细胞的迁移和侵袭。Liu等[12]发现FEZF1-AS1在肺腺癌组织中表达水平显著上调，FEZF1-AS1可能影响肺腺癌的发生。本研究发现，FEZF1-AS1表达水平在喉癌组织中显著高于正常喉癌旁黏膜组织，说明FEZF1-AS1在喉癌组织表达水平上调，提示FEZF1-AS1可能参与喉癌的发生。Zhang等[13]研究发现FEZF1-AS1高表达与宫颈癌组织学分级、远处转移阳性、临床分化显著相关。本研究进一步研究发现，FEZF1-AS1表达水平与喉鳞状细胞癌患者临床分期、T分级、淋巴结转移有关，提示喉癌病情发展可能与FEZF1-AS1表达水平变化密切相关，FEZF1-AS1在喉癌中可能发挥重要作用。

有文献报道，FEZF1-AS1与肺腺癌、大肠癌、肺鳞状细胞癌[14]、胰腺导管腺癌[15]等肿瘤的生长及预后显著相关，可作为预后的临床指标。Ye等[15]在胰腺导管腺癌研究中发现FEZF1-AS1高表达与胰腺导管腺癌术后生存率相关，是影响肿瘤患者病死率的重要因素。Zhang等[13]研究宫颈癌预后不良与FEZF1-AS1关系时发现，FEZF1-AS1表达水平是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素。本研究发现，FEZF1-AS1高表达喉癌患者中位生存时间显著低于低表达肿瘤患者中位生存时间，提示FEZF1-AS1高表达喉癌患者预后较差。COX多因素分析发现，有淋巴结转移、FEZF1-AS1高表达是喉癌患者不良预后的独立危险因素，提示FEZF1-AS1有可能成为预测喉癌预后不良的生物标志物之一，FEZF1-AS1高表达喉癌患者应做好术后复查。

综上所述，FEZF1-AS1在喉癌组织表达水平上调，FEZF1-AS1高表达是喉癌患者预后不良独立危险因素，FEZF1-AS1有可能成为预测喉癌预后不良的生物标志物之一，为我们治疗喉癌提供新视野。但FEZF1-AS1与喉癌发生、发展机制有待进一步研究。