沉默eIF3b基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖、侵袭和迁移能力的影响*

李延辉， 方茅， 谢敏如， 夏明汗

1东莞市石碣医院病理科(广东东莞 523290)； 2广州医科大学病理教研室(广东广州 511483)； 3暨南大学附属第一医院病理科(广东广州 510630)

流行病学调查研究资料显示乳腺癌发病率占所有威胁女性健康的恶性肿瘤的15.0%左右，已经成为世界范围内威胁女性生命最主要的疾病之一[1]。乳腺癌恶性程度高，进展快，大部分患者发现时已经中晚期甚至晚期，其治疗仍是一个难点，患者往往发生全身转移而导致病死率较高。近年来乳腺癌的分子生物靶向药物治疗新靶点已成为众多学者关注和研究的热点。因此，探讨乳腺癌的侵袭和转移等恶性进展的分子机制，从中寻找新的分子靶点，将为预估和干预乳腺癌的増殖、侵袭和迁移过程提供新的研究方向[2]。真核细胞起始因子(eIFs)属于参与真核生物蛋白质合成起始调控过程中的重要蛋白超家族，目前发现eIFs不仅参与了机体细胞生长、增殖的调节过程，更在肿瘤细胞恶性增殖和恶性转化的过程中发挥重要作用。新近的文献报道结果显示eIF3的亚基eIF3b在包括乳腺癌在内的各种恶性肿瘤中存在表达异常，并发现可能参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等恶性进展过程[3-4]。然而，以eIF3b为切入点，揭示调控乳腺癌增殖、侵袭和迁移的相关机制，目前国内尚无相关报道。2019年9—11月，本研究以人乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象，通过设计eIF3b基因的小分子干扰RNA(siRNA)片段，沉默eIF3b基因后，观察细胞增殖、侵袭及迁移能力的变化；并检测转染后细胞迁移与侵袭标志蛋白和抑迁移蛋白钙黏蛋白E(E-cadherin)表达的变化，进而探讨eIF3b基因在乳腺癌发生、发展过程中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞系MCF-7购自中科院上海细胞库；10%胎牛血清、RPMI 1640培养基以及脂质体lipofectamineTM2000均购自Hyclone公司，Total RNA提取试剂盒购自OMEGA公司，BCA法蛋白定量测定试剂盒购自海门碧云天生物技术公司，eIF3b抗体购自Invitrogen公司(美国)，vimentin抗体、MMP-2抗体、MMP-9抗体和E-cadherin均购自Abcam公司，Transwell小室和Matrigel胶分别购自Corning公司和Bio-Rad公司，其余试剂和材料均购自Sigma Aldrich公司。中国上海博尚生物有限公司合成引物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7放置于RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)在培养箱进行培养，细胞培养的环境条件：37℃，5% CO2饱和湿度。

1.2.2 实验分组和转染 转染实验分3个组：Control组(空白对照组)、Scramble组(转染非特异性对照组)和eIF3b-siRNA组(转染eIF3b-siRNA组)。转染实验过程严格按Hyclone公司lipofectamineTM2000操作说明书进行转染，其中eIF3b-siRNA组加入20 nmol/L转染eIF3b-siRNA，而Scramble组加入20 nmol/L Scramble RNA，Control组不做任何处理，转染24 h后收集细胞。

1.2.3 实时定量聚合酶链反应(RT-PCR法)检测 严格按照Trizol RNA提取试剂盒说明书里的操作步骤进行提取总RNA实验，提取各组细胞的总RNA后，按照RT-PCR逆转试剂盒操作说明进行RT-PCR法反应。eIF3b上游引物5′-CGGTGCCTTAGCGTTTGTG-3′，下游引物5′-CGGTCCTTGTTGTTCTTCTGC-3′。

1.2.4 Western blot法 严格按照试剂盒说明书里的操作步骤进行，提取转染后各组细胞的总蛋白，应用Bradford法对蛋白浓度进行测定；配制分离胶，进行蛋白电泳(120 V，90 min)；电泳结束后转膜50 min，加入5%脱脂牛奶室温下封闭2 h；然后加入相应一抗(eIF3b、vimentin、MMP-2、MMP-9和E-cadherin,稀释比例均为1∶1 000)和小鼠抗人β-actin，孵育过夜；第2天加入二抗(稀释比例均为1∶10 000)，室温摇床2 h后加入试剂显影；运用Quantiy one软件对蛋白条带灰度值进行计算分析。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 将各组 MCF-7 细胞以每孔1×104·mL-1接种于96孔板，每组设3个复孔，分别在培养0、24、48、72和96 h后加入10 μL/孔的 CCK-8试剂液继续培养2 h，应用酶标仪对各孔进行吸光度(A)值检测，在570 nm波长处检测，重复检测3次。细胞增殖抑制率的计算公式：(空白组A值-实验组A值)/空白组A值×100%。

1.2.6 细胞迁移和侵袭实验 迁移实验时，收集转染后的各组细胞，按 2×104个细胞/孔在Transwell小室的上室接种细胞，取含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基500 μL加入下室，置于培养箱中进行常规培养36 h后取出小室，立即用棉签擦拭上室细胞，经过固定染色后，在显微镜下观察，随机取5个视野计数迁移细胞(×100)，每组重复3次，取其平均值反映细胞迁移能力。侵袭实验时，将含6.7% Matrigel胶(细胞外基质胶)的培养液均匀铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上，37℃条件下孵育1 h。取各组细胞悬液，加入Transwell小室(铺 Matrigel胶)，在Transwell小室的下室中加入RPMI 1640培养液，置入培养箱进行培养，结束后，取出小室立即用棉签擦拭上室细胞和Matrigel胶，其余步骤参照迁移实验。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件，各组细胞的检测指标先进行单因素方差分析，两组之间的检测指标比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默eIF3b对乳腺癌细胞eIF3b mRNA和蛋白表达水平的影响 RT-PCR结果显示eIF3b-siRNA组eIF3b mRNA相对表达水平为0.54±0.08，明显低于Control组(1.08±0.18)和Scramble组(1.12±0.16)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。Control组和Scramble组eIF3b mRNA表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹法结果显示：与Control组(1.09±0.19)、Scramble组(1.05±0.17)相比，eIF3b-siRNA组eIF3b蛋白表达水平(0.45±0.06)明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、3，Control组和Scramble组eIF3b蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组MCF-7细胞eIF3b的mRNA表达

图2 各组MCF-7细胞eIF3b的蛋白相对表达量

图3 各组MCF-7细胞eIF3b的蛋白表达水平

2.2 沉默eIF3b对乳腺癌细胞增殖能力的影响 随着培养时间的延长，eIF3b-siRNA组细胞增殖抑制率逐渐升高，与Control组和Scramble组在不同培养时间点上比较，eIF3b-siRNA组细胞增殖抑制率均明显高于其余两组(P<0.05)，见表1。而Control组和Scramble组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组不同时间MCF － 7 细胞增殖抑制率

2.3 沉默eIF3b对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响 细胞迁移和侵袭实验中，eIF3b-siRNA组迁移和侵袭的细胞数均明显少于Control组和Scramble组(P<0.05)，见表2，而Control组与Scramble组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

表2 沉默eIF3b对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响 个

图4 各组MCF-7 细胞迁移和侵袭能力(×100)

2.4 沉默eIF3b对乳腺癌细胞迁移和侵袭相关蛋白表达的影响 Western blot法结果显示：与Control组和Scramble组比较，eIF3b-siRNA组细胞迁移和侵袭相关蛋白波形蛋白(vimentin)(0.26±0.02)、基质金属蛋白酶(MMP)-2(0.23±0.02)和 MMP-9(0.46±0.03)表达水平明显减弱(P<0.05)，而抑制细胞迁移蛋白 E-cadherin(1.32±0.19)表达水平明显增强，而Control组与Scramble组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3及图5、6。

图5 各组MCF-7细胞迁移和侵袭相关蛋白相对表达比较

表3 各组MCF-7细胞迁移和侵袭相关蛋白相对表达量比较

图6 各组MCF-7细胞迁移和侵袭相关蛋白表达水平

3 讨论

近年来乳腺癌患者的生存率得到一定程度的提高，这归功于临床治疗方法的不断革新，尤其是分子生物靶向治疗的应用，但对于一些复发转移的乳腺癌患者，发生全身转移后死亡率仍然很高[5]。因此，通过探讨乳腺癌的无限增殖、浸润和转移的发生机制，寻找分子生物靶向药物治疗新靶点一直是目前医学界防治乳腺癌的热点研究问题。

eIF3是eIFs超家族中最重要的亚基之一，它存在多种许多亚基，如eIF3a、eIF3e、eIF3f、eIF3h、eIF3i等，目前已在多种恶性肿瘤组织中检测到eIF3多种亚基的异常高表达，认为它们可能参与了多种人类恶性肿瘤的发生发展过程[6-7]。其中对eIF3发挥功能的核心亚基eIF3b与肿瘤相关性的研究也不少见。研究设计沉默eIF3b基因表达，能有效抑制结肠癌细胞，骨肉瘤细胞和膀胱癌细胞的增殖能力[8-10]。国内也有研究[11-13]发现，下调eIF3b的表达，能有效抑制胶质瘤细胞、肝癌 SMMC-7721细胞及胃癌细胞的增殖，并能促进细胞侵袭和迁移过程。因此，eIF3b与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关是毋庸置疑的。

本研究设计沉默eIF3b基因表达的干扰RNA(siRNA)片段，转染入乳腺癌细胞株MCF-7，结果发现转染后乳腺癌细胞eIF3b基因mRNA和蛋白表达水平明显下调 (P<0.05)。表明转染siRNA后，乳腺癌细胞株MCF-7中eIF3b基因被有效沉默，明显地抑制了其mRNA和蛋白表达。

无限增殖是肿瘤细胞的特性之一，也是肿瘤形成和恶性进展的重要机制，寻找干预参与细胞增殖和凋亡的靶基因，可能成为治疗肿瘤的有效分子靶点[14]。本研究采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率，结果显示沉默eIF3b基因的表达后，乳腺癌细胞株MCF-7的细胞增殖抑制率明显提高，表明乳腺癌细胞株MCF-7转染siRNA后，随着eIF3b基因表达被沉默，癌细胞的增殖受到有效地抑制，也提示eIF3b可能成为治疗乳腺癌的潜在靶点。

研究发现，肿瘤浸润和转移的发生不仅与肿瘤细胞在原发灶的增殖生长能力有关，同时与肿瘤细胞突破周边组织和血管基底膜的潜能密切相关，具有较强的迁移和侵袭能力的肿瘤细胞，其体外生存能力更强，体内发展恶性进展的能力也随之提高，更容易发生复发和转移，因此如何有效预防和抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭过程是一项重要的研究课题。本研究采用Transwell小室模型实验分析沉默eIF3b对乳腺癌细胞迁移的影响，结果显示沉默eIF3b表达后乳腺癌细胞的迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显减少，说明抑制eIF3b的表达对乳腺癌细胞MCF-7的迁移和侵袭产生了较强的抑制作用，也进一步证明了eIF3b对乳腺癌细胞迁移和侵袭的恶性行为具有重要的调控作用，这将为乳腺癌靶向治疗提供一个新的切入点。

肿瘤细胞的迁移和侵袭过程涉及众多信号通路和功能蛋白的异常表达，其中跨膜蛋白 E-cadherin的表达下调或缺失、vimentin和基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)表达异常增高，均已经被证实是参与细胞迁移和侵袭过程的关键调控蛋白[15-16]。本研究通过Western blot检测了乳腺癌细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达水平，结果显示，沉默eIF3b基因后，乳腺癌细胞中迁移和侵袭相关蛋白vimentin、MMP-2和 MMP-9的表达下调，同时抑制细胞迁移蛋白 E-cadherin的表达明显提高，这表明沉默eIF3b基因可有效地抑制乳腺癌细胞的黏附性，阻止癌细胞与内皮细胞基底膜之间的作用和上皮-间质转化，同时抑制了癌细胞的游离，阻碍癌细胞形成转移灶。

综上所述，本研究证实下调eIF3b表达可有效地减弱乳腺癌细胞MCF-7增殖、侵袭和迁移能力。该作用可能与阻碍乳腺癌细胞的上皮-间质转化过程和促进MMP-2和MMP-9的分泌有关。但本研究仅是eIF3b在乳腺癌发病过程中作用机制的体外实验初步探讨，且机制分析的深度不够，eIF3b能否作为治疗乳腺癌复发和转移的新靶点仍需要动物体内实验及更深入的分子机制分析进一步证实。