基于OSMAC策略的3株海洋真菌发酵条件筛选与优化

刘亚月，梁健文，薛欣怡，梁金月，马小翔，张 翼

基于OSMAC策略的3株海洋真菌发酵条件筛选与优化

刘亚月，梁健文，薛欣怡，梁金月，马小翔，张 翼

（广东海洋大学食品科技学院 // 广东省水产品加工与安全重点实验室 // 广东省海洋生物制品工程实验室 // 广东省海洋食品工程技术研究中心 // 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室 // 广东海洋大学海洋药物研究所，广东 湛江 524088）

【】筛选可促进海洋真菌产生代谢产物更丰富的发酵条件，进一步挖掘菌株在抗阿尔茨海默症方面的潜力。基于OSMAC策略，分别选用马铃薯葡萄糖水（PDB）培养基、察氏培养基、大米培养基和葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(GPY) 培养基，并设置3种盐度（3、30和100），对sp. 001、sp. 019和ZN4-5-4 等3株海洋真菌进行小规模发酵培养。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化，并根据TLC指纹图谱、乙酰胆碱酯酶 (AChE) 抑制、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段筛选出代谢产物丰富、毒性小且AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富的发酵培养条件。菌株001的最优发酵条件是盐度3的GPY培养基，菌株019的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基，菌株ZN4-5-4的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基。OSMAC策略指导下，改变培养基条件对菌株产生次生代谢产物有显著影响。

OSMAC；海洋真菌；次生代谢产物；抗乙酰胆碱酯酶；抗氧化

阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD) 是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、执行功能障碍，以及人格和行为改变等为特征，多发于60岁以上老人[1-2]。2018年全球该病患者高达5 000万，我国AD患者人数超过1 000万，已居世界第一[3-4]。近20年来，研发的AD药物临床失败率高达99.6%[5]，有效的AD药物开发已迫在眉睫。目前，他克林、多奈哌齐、毒扁豆碱、加兰他敏、石杉碱甲、利斯的明等[6-7]乙酰胆碱酯酶 (AChE) 抑制剂是改善AD的最常用药物，该类药物可抑制AChE活性，显著增加中枢乙酰胆碱含量。自由基清除药物也可改善AD[8]。而微生物资源是AChE抑制剂和自由基清除药物的天然来源，相关研究渐多。由于目前临床上使用的AChE抑制剂多存在半衰期较短、副作用较大等缺点，不利于患者的长期服用[9]，因此，从微生物中寻找新的选择性高、毒副作用小的AChE抑制剂广受关注。

OSMAC（One Stain-Many Compounds）策略[10-12]，亦称单菌株多次级代谢产物策略，是通过改变培养基营养成分、状态，添加酶抑制剂，调控表观遗传，混合培养等方法，充分挖掘微生物合成次级代谢产物的能力，从而获得更多类型的次级代谢产物。还可通过改变C、N源，C/N比，盐度，金属离子的种类和含量，培养体系pH值，培养温度，培养时间等培养条件来刺激微生物，激活不同的合成基因簇，挖掘其产生不同代谢产物的能力，从而获得骨架新颖、活性高的新化合物。刘炳新[13]基于OSMAC策略研究一株南海软珊瑚共附生真菌NG-15-3时，发现不同培养基可获得不同的代谢产物；王晓丽[14]采用OSMAC策略从极地海洋真菌sp. D-1发酵物中成功分离到20个海松烷型二萜类化合物，部分化合物显示了一定的抗病毒活性和较强烈的细胞毒活性。因此，利用OSMAC策略可有效激活菌株的代谢能力，获得丰富、结构新颖且有生物活性的代谢产物。

在AD药物开发过程中，既要考虑药物本身对患者的药效，还要考虑药物对患者神经系统的副作用。因此，在粗提物组分活性筛选时，需要避免有强毒性的先导化合物。笔者基于OSMAC策略，对sp. 001、sp. 019和ZN4-5-4等3株海洋真菌分别选用4种不同培养基、在3种盐度下进行小规模发酵培养，并用TLC (Thin Layer Chromatography)指纹图谱、乙酰胆碱酯酶 (Acetylcholinesterase, AChE) 抑制、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术对菌株次生代谢产物的生物多样性和化学多样性，以期挖掘出各菌株代谢产物丰富、毒性小且AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富的发酵培养条件，为深入研究这三株菌株的代谢潜力，挖掘抗AD相关活性先导化合物提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 海洋真菌sp. 001和019sp.分离自2016年采于湛江红树林自然保护区的红树植物杨叶肖槿（），经ITS rDNA全序列分析确定为黄丝曲霉菌（Genbank登录号：MN826194）和青霉菌（Genbank登录号：MN826202）；海洋真菌ZN4-5-4则是分离自2017年采集于琼州海峡的沉积泥，经ITS rDNA全序列分析确定为曲霉菌（Genbank登录号：MN826203）。3株菌株均保存于广东海洋大学海洋药物研究所。

1.1.2 主要仪器与试剂 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Epoch2酶标仪，美国BioTek公司；R-300旋转蒸发仪，瑞士BüChi公司；多功能紫外透射仪WFH-201B，上海精科实业有限公司；HP Plus 50D超高压液相色谱仪，苏州利穗有限公司。

乙酰胆碱酯酶（C3389）、碘代硫代乙酰胆碱 (Acetylthiocholine iodide, ATCI，DA0048）、牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA，A1933)、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH，D9132)，均购自Sigma-Aldrich；5, 5’-二硫代二硝基苯甲酸 (Dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB，D8130)，购自Ruibio公司。其余试剂均为国产分析纯试剂。GF254硅胶高效薄层层析板购自德国默克公司。盐水虾幼虫卵购自中国爱家水族馆。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖水（Potato-dextrose Broth,PDB）培养基：蔗糖20 g，蛋白胨5 g，海盐适量（盐度3时添加量为3 g，盐度30时添加为30 g，盐度100时添加量为100 g），加入纯水至1 L，于121 ℃下灭菌30 min。

大米培养基：大米50 g，海盐适量（盐度3时添加量为3 g，盐度30时添加为30 g，盐度100时添加量为100 g），加纯水定容至1 L，于121 ℃下高压灭菌30 min。

葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(Glucose/Peptone/Yeast, GPY）培养基：葡萄糖2.0 g，蛋白胨0.6 g，酵母膏1.4 g，K2PO40.2 g，MgSO4•H2O 0.1g，海盐适量（盐度3时添加量为3 g，盐度30时添加为30 g，盐度100时添加量为100 g），加纯水定容至1 L，121 ℃下高压灭菌30 min。

察氏培养基（盐度30）：蔗糖30 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，NaNO32 g，海盐30 g，加纯水定容至1 L，于121 ℃下高压灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 OSMAC策略下菌株的小规模培养 将平板培养的长势状况良好的菌株001、019、ZN4-5-4分别接种到10种不同的培养基（盐度3、30、100的PDB培养基，盐度3、30、100的大米培养基，盐度3、30、100的GPY培养基，盐度30的察氏培养基），培养物分别记为A1-A10、B1-B10、C1-C10。每组设置2个平行组，于28 ℃、100 r/min条件下摇床培养14 d，观察菌株在不同培养基中生长状态的变化。

1.2.2 菌株次生代谢产物的提取 将培养后的菌株分别用不同方法提取次生代谢产物。对PDB培养基发酵液、察氏培养基发酵液和GPY培养基发酵液分别加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次，减压浓缩，得粗提物；而大米培养基发酵物则通过加入等体积的甲醇进行浸泡提取，超声30 min，过滤，将甲醇提取液减压浓缩，得粗提物。最后干燥、称量粗提取物质量（）。

1.2.3 菌株次生代谢产物的TLC图像分析 将上述粗提物用甲醇配制成10 mg/mL的浓缩液，采用硅胶薄层层析板对各粗提物的化学多样性进行分析。选择氯仿∶甲醇= 7∶1二元溶剂体系作为TLC分析的展开剂，并在波长254 nm和365 nm下观察代谢产物的分布情况，最后用碘化铋钾试剂进行显色，对次生代谢产物中含氮类次生代谢产物进行追踪分析。

1.2.4 菌株次生代谢产物的AChE抑制活性测定通过优化的Ellman比色法[15]测定粗提物对AChE体外抑制活性。

初筛：将各粗浸膏溶解于二甲基亚砜（DMSO）并配成1 mg/mL的浓缩液，在96孔板每孔中加1 μL的样品，再依次加入49 μL磷酸盐缓冲液（PBS）、10 μL 0.2 U/mL AChE和20 μL DTNB，将96孔板置于37 ℃培养箱保温10 min。然后每孔加入20 μL ATCI，继续于37 ℃培养箱孵育20 min后，通过酶标仪测定405 nm处的光密度值，以盐酸化多奈哌齐作为阳性对照。通过下述公式计算化合物对AChE的抑制率，其中s,0为加入样品和BSA但不加入AChE的光密度，s为加入样品和AChE的光密度，c为加入AChE但不加入样品的光密度，0为加入BSA但不加入样品和AChE的光密度。

抑制率=[(c－0)－(s－s,0)]/(c－0)。

复筛：经初筛后，选择AChE抑制率大于50%的样品进行活性复筛。采用倍半梯度稀释法对样品进行稀释后，按照上述方法测定各粗提物的IC50值（化合物对AChE抑制为50%所对应的浓度）。用软件Origin 8.0对抑制率和浓度对数（ln）进行三次多项式回归方程拟合，得浓度对数曲线，并算得ln（IC50），用Microsoft Excel算得IC50。

1.2.5 菌株次生代谢产物的DPPH自由基清除活性测定 使用Sharma和Bhat描述的DPPH自由基清除法[16]，在96孔板中测定粗提物的抗氧化能力。

初筛：总反应体系为100 μL，样品为含50 μL 0.16 mmol/L PPH和50 μL 1 mg/mL粗提物(溶解)的DMSO（s）。用50 μL 0.16 mmol/L DPPH和50 μL DMSO作对照（c），50 μL 甲醇和50 μL溶解不同浓度化合物的DMSO作为样品本底（s,0），50 μL和50 μL DMSO作为空白（0）。将96孔板放置在暗处30 min，通过酶标仪测定517 nm处的光密度。用维生素C为阳性对照。

抑制率=[(c－0)－(s－s,0)]/(c－0)。

复筛：经初筛后，选择DPPH自由基清除率大于50%的样品进行活性复筛。采用倍半梯度稀释法稀释样品，按照1.2.4方法测定各粗提物的EC50值（化合物对DPPH自由基清除率为50%所对应的浓度）。将清除率和浓度对数（ln）导入Origin 8.0软件。用软件Origin 8.0对清除率和浓度对数（ln）进行三次多项式回归方程拟合，得浓度对数曲线，并算得ln（EC50），用Microsoft Excel算得EC50。

1.2.6 菌株次生代谢产物的卤虫致死活性测定[17]采用96孔板法，用盐水虾幼虫测试化合物的致死能力。每孔加199L含卤虫幼体的溶液（每孔约含20只卤虫），制成测试培养板。将粗提物用DMSO配制成10 mg/mL的溶液，加入1L DMSO溶液到每个培养板孔中，每个粗提物样品设置成500 g/mL终浓度，设3个平行样。在28 ℃的培养箱中保持光照培养24 h后，记录每孔中死亡幼虫数量和总数。同时，用DMSO和CuSO4分别作为空白对照和阳性对照。卤虫致死活性采用卤虫致死率表示：

卤虫致死率 =[（加药致死率－空白组对照致死率）/ 空白对照组存活率]。

2 结果与分析

2.1 菌株培养的表观形态对比

用10种培养基对3株海洋真菌进行小规模培养结果如图1所示。

A, 菌株001; B, 菌株019; C, 菌株ZN4-5-4。1-3：盐度3、30、100的PDB培养基；4-6：盐度3、30、100的大米培养基；7-9：盐度3、30、100的GPY培养基；10：盐度30的察式培养基。

对同一菌株而言（以菌株001为例），随着培养基条件的变化，菌株的生长形态发生较明显的变化（A1-A10）。在PDB培养基中，菌株001为白色的菌丝体，菌液为淡黄色，随着盐度的增加，菌液颜色也逐渐加深（A1-A3）；在大米培养基中，菌株001为青色的菌丝体，随着盐度的增加，菌丝体的生长越来越旺盛（A4-A6）；在GPY培养基中，菌株001也为白色菌丝体，菌液则为红褐色，菌液颜色随着盐度的增大也逐渐加深（A7-A9）；在盐度30的察式培养基中，菌株001也为白色菌丝体，菌液则为白色（A10）。同理，也可在菌株019（B1-B10）和ZN4-5-4（C1-C10）中观察到生长形态的变化。由此推测，菌株在不同培养基条件下代谢产物可能不同。

2.2 菌株次生代谢产物的产量分析

用不同溶剂提取的小规模培养后菌株次生代谢产物质量见图2。结果表明，对3株海洋真菌而言，大米培养基条件下各菌株代谢产物产量均最高（均大于2.4 g），且随着盐度的增加，产量总体呈上升趋势。此外，菌株001在盐度3的PDB培养基（= 0.25 g）和察氏培养基（= 0.38 g）条件下的产量相对较高；菌株019在盐度3的PDB培养基（= 0.26 g）和盐度10的GPY培养基（= 1.58 g）条件下的产量较高；菌株ZN4-5-4在盐度3和30的PDB培养基（分别为0.39、0.41 g）和盐度30的察式培养基（= 0.63 g）条件下产量较高。

图2 各菌株在不同培养基条件下的提取物质量

2.3 菌株次生代谢产物的TLC图像分析

各菌株代谢产物化学多样性分析结果见图3。图3可知，PDB培养基（盐度3、30和100）和GPY培养基（盐度3）条件下，3株海洋真菌的代谢产物种类均比大米培养基丰富。进一步分析图3（a1、a2）可知，在盐度30的GPY培养基条件下，菌株001的代谢产物种类相对丰富。而在盐度30的察氏培养基条件下，菌株019的代谢产物种类也较为丰富（图3：b1-b2）。同理，盐度100的GPY培养基条件下菌株ZN4-5-4代谢产物种类丰富度也较大。菌株001会产生含氮类的次生代谢产物（图3：a3）；菌株019则只在盐度3的大米培养基中产生含氮类次生代谢产物（图3：b3）；菌株ZN4-5-4在各种培养基条件下不产生含氮类次生代谢产物（图3：c3）。

2.4 菌株次生代谢产物的生物活性测定

各菌株粗提物的AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和卤虫致死活性见表1。表1可见，不同培养条件下的菌株001粗提物AChE抑制活性弱或者无，但却显示较好的抗氧化活性，在盐度30、100的PDB培养基，盐度3的大米培养基，盐度3的GPY培养基，盐度30的察式培养基条件下，其粗提物的DPPH自由基清除率均大于50%。对菌株019而言，在盐度3的PDB培养基条件下获得的次生代谢产物表现出显著的AChE抑制活性（抑制率为81.8%）；而在PDB（盐度3、30和100）培养基、大米培养基（盐度3、30）和察式培养基的条件下的次生代谢产物则显示明显的抗氧化活性（清除率均大于50%），尤其是在盐度30的PDB培养基条件下获得的次生代谢产物的清除率为92.1%。菌株ZN4-5-4在盐度3和30的PDB培养基条件下的次生代谢产物则同时具有显著的AChE抑制活性和抗氧化活性（自由基清除率为89.1%）；同时在盐度3的GPY培养基条件下的次生代谢产物具有显著的AChE抑制活性（抑制率为89.5%）；在盐度100的PDB培养基条件下的次生代谢产物则具有显著的抗氧化活性。

a、b、c分别代表菌株001、019、ZN4-5-4；1、2、3分别为各粗提物的254 nm紫外图像、365 nm荧光图像和碘化铋钾显色图像

表1 粗提物的AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和卤虫致死活性

对各粗提物的卤虫致死活性进行分析可知，菌株001在盐度100的大米培养基和不同盐度的GPY培养基条件下的次生代谢产物卤虫致死率低于50%，因此，大米培养基（盐度100）、GPY培养基（盐度3、30、100）是菌株001产物毒性较低的条件。同理可知，大米培养基（盐度100）、察氏培养基（盐度30）、GPY培养基（盐度30和100）是菌株019产物毒性较低的条件。而大米培养基（盐度3）、察氏培养基（盐度30）、GPY培养基（盐度3、30和100）是菌株ZN4-5-4产物毒性较低的条件。

经初筛后，抑制率或者清除率大于50%的样品活性复筛结果（表2和表3）表明，菌株ZN4-5-4在盐度3、30、100的PDB培养基条件下的次生代谢产物具有显著的DPPH自由基清除活性，EC50值分别为35.5、23.6、48.6 μg/mL。而其他粗提物均显示弱的清除活性（EC50> 100 μg/mL）。同时，该菌株在盐度3的GPY培养基条件下的代谢产物还显示较强的AChE抑制活性，其IC50值为82.4 μg/mL。

表2 部分样品的AChE的抑制活性

说明Note：1) 阳性对照positive control。

表3 部分样品的DPPH自由基清除活性

说明Note：1）阳性对照positive control。

3 讨论

高盐、高压、低温和低营养的海洋生态环境，使生长在其中的海洋微生物具有独特的代谢机制，可产生骨架新颖、活性显著的活性物质[18]。但传统单一的培养模式下，大多数微生物的合成基因簇不表达或以极低水平表达，处于沉默状态。因此，如何利用现有的研究成果和技术手段激活这些沉默基因以获取新型微生物天然产物已成为当务之急[19]。一些学者利用OSMAC策略对海洋真菌进行培养，证明通过改变菌株的培养条件可达到发掘菌株潜能、激活沉默基因表达的目的。如Numata等[20-21]以2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母浸膏和人工海水（pH 7.0）为培养基培养海藻的附着真菌sp.OUPS-79，从中分离到12个吲哚生物碱类化合物，而将其中的酵母浸膏改为麦芽浸膏（其他成分不变）时，则获得11个完全不同的次生代谢产物。如Liu等[22]对海洋真菌AS-53的研究中，发现当采用液体培养基进行培养时，得到双硫二酮哌嗪生物碱类化合物；而使用大米培养基进行发酵时，则可获得倍半萜类化合物。本研究中，分别采用PDB培养基、察氏培养基、大米培养基和GPY培养基，并设立3种盐度（3，30和100）对三株海洋真菌进行培养时，相对于固体培养基（大米培养基），液体培养基（PDB培养基、GPY培养基和察式培养基）产生的代谢产物种类更丰富，但是产量较低。而液体培养基中，PDB培养基普遍显示较好的AChE抑制和抗氧化活性，GPY培养基则显示较弱的毒性。推测可能是由固、液培养基中的碳源差异所致。有研究[23]表明，碳源是培养基中重要的营养物质之一，它为菌体生长与代谢提供了物质基础与能量。碳源不同，菌体对碳源种类的利用程度不同，从而造成菌体产生的代谢产物种类和产量不同。大米培养基以淀粉作为碳源，而液体培养基均则以葡萄糖或者蔗糖为碳源。可见，相比淀粉，3株海洋真菌对葡萄糖和蔗糖的利用效果更佳。

另外发现，仅大米培养基对于含氮类次生代谢产物的产生有一定激活作用，而液体培养基对含氮类次生代谢的产生激活效果不显著，这可能与培养基的成分、发酵规模、发酵时间等因素有关。

4 结论

对sp. 001、sp. 019和ZN4-5-4等3株海洋来源真菌，本研究采用OSMAC策略研究不同培养基和盐度条件下对真菌次生代谢产物的影响。综合菌株次生代谢产物的产量、种类、AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和卤虫致死活性分析，确定了菌株001的最佳发酵条件是盐度3的GPY培养基，菌株019的最佳发酵条件是盐度3的PDB培养基，菌株ZN4-5-4的最佳发酵条件是盐度3的PDB培养基，表明OSMAC策略对菌株的次生代谢产物有显著影响。3株菌株的具体化学成分研究正在深入进行，有待后续报道。

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Screening and Optimization of Fermentation Conditions on Three Marine Fungi Based on the OSMAC Strategy

LIUYa-yue，LIANGJian-wen，XUEXin-ying，LIANGJin-yue，MAXiao-xiang，ZHANG Yi

（//////////,524088,）

To obtain the optimal fermentation culture conditions for more abundant metabolites, and exploite the potential of strains in drugs targeting Alzheimer’s disease.Based on the OSMAC strategy, three marine-derived fungisp. 001,sp. 019 andZN4-5-4 were cultured by potato-dextrose broth (PDB) medium, Czapek’s medium, rice medium and glucose / peptone / yeast extract (GPY) medium with three different salinities (i.e. 0.3%, 3%, and 10%). The morphological variations of the mycelia were observed. Then, based on the thin layer chromatography (TLC) fingerprints, acetylcholinesterase (AChE) inhibitory, 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging, and artemia lethality activities screening models, the fermentation conditions with rich metabolites, low toxicity and rich anti-acetylcholinesterase and antioxidant products were initially screened.The optimal fermentation condition for strain 001 is with PDB medium in salinity 0.3%; the optimal fermentation condition for strain 019 is with PDB medium in salinity 0.3%; the optimal fermentation conditions for srain ZN4-5-4 is with PDB medium in salinity 0.3%.Under the OSMAC strategy, the conditions of the medium exert significant effect on the production of secondary metabolites of the strain.

OSMAC; marine fungus; secondary metabolites; anti-acetylcholinesterase; antioxidant

R282.71；Q949.325

A

1673-9159（2020）03-0065-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.009

2019-12-19

国家自然科学基金（21807015）；广东海洋大学博士启动项目（R18008）；广东省扬帆计划引进紧缺拔尖人才项目（201433009）；广东省自然科学基金（2018A030307046）；深圳市科创委基础研究自由探索项目（JCYJ20170306165013264）；广东省应用科技研发重大专项（2016B020235001）；广东省促进经济发展专项资金(海洋经济发展用途)项目(粤自然资源合[2019] 015号)；深圳市大鹏新区产业发展资金(KY20180203及PT201901-05)；湛江市海洋渔业局项目（A18018）

刘亚月（1989―），女，讲师，研究方向为海洋天然产物。Email：yayue_liu@163.com

张翼，男，教授，研究方向为海洋天然产物。Email：hubeizhangyi@163.com

刘亚月，梁健文，薛欣怡，等. 基于OSMAC策略的3株海洋真菌发酵条件筛选与优化[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（3）：65-72.

（责任编辑：刘庆颖）