制备肝郁脾虚湿盛证溃疡性结肠炎大鼠模型初探

2020-08-30李艺垚马少丹苑述刚

福建中医药 2020年4期

李艺垚，马少丹，苑述刚

（福建中医药大学药学院，福建福州 350122）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因复杂的直肠和结肠慢性非特异性炎症性疾病，属中医“泄泻”“痢疾”“腹痛”等范畴，发病率逐年上升。因其发病机制尚未明确，该病近年来一直是研究热点，最安全有效的方法就是通过建立动物模型进行相关研究。目前制备UC 模型的方法主要有：化学刺激法、免疫刺激法、复合法等，常见的UC 中医证型模型有：① 肝郁脾虚型［1-2］；② 脾虚（湿蕴）型［3］；③ 大肠湿热型［4］；④ 脾肾阳虚型［5］。

中医学根据其证型采用相应的主方加减治疗UC 能取得较好疗效［6-7］，本实验为研究久泻宁颗粒的治疗机制的前期实验。久泻宁颗粒是原福建中医学院院长俞长荣教授治疗慢性泄泻的经验方，临床治疗肝郁脾虚湿盛证之UC 疗效确切。而现有的UC 大鼠模型与本课题实验所需大鼠模型均不相符合，故本实验拟采用DSS 溶液灌胃结合饮食、环境、情绪等因素干预，与单纯采用DSS 溶液灌胃的造模方法进行比较，试建立一种稳定的肝郁脾虚湿盛证之UC 大鼠模型。

1 材料

1.1 动物与分组 SPF 级SD 大鼠18 只，雌雄各半，体质量（170±20） g，由浙江省实验动物中心提供（许可证号：SCXK（浙）2014-0001）。实验动物在福建中医药大学动物实验中心饲养和管理（环境设施合格证书：SYXZ（闽）2014-0005）。随机分为正常对照组、葡聚糖硫酸钠组（DSS 组）、模型组，每组 6 只。

1.2 试剂 DSS（大连美仑生物技术有限公司，批号：S0808A）；猪油（天津聚龙粮油有限公司，批号：20180912C）；0.9%氯化钠注射液（江西科伦药业有限公司，批号：B18120702）。

1.3 仪器生物组织自动脱水机（亚光医用电子技术有限公司，型号：ZT-14S1）；生物组织石蜡包埋机（湖北锦源医用电子技术有限公司，型号：YJ-BMC）；石蜡切片机（德国 Leica 公司，型号：RM2235）；摊烤片机（孝感市亚光医用电子技术有限公司，型号：YT-7FB）；研究级生物显微镜（德国Leica 公司，型号：DM4000B）。

2 方法

2.1 造模方法参照相关文献［8-10］并加以改进：大鼠适应性喂养1 周，正常对照组予正常饲养，每日予生理盐水灌胃2 次，每次2 mL，连续7 d。 DSS组每日灌胃 10% DSS 溶液 20 mL/kg，2 次 /d，连续7 d。模型组采用DSS 组造模方法外，单日禁食，并予4 ℃冰水灌胃，每日1 次，每次2 mL；双日正常饮食，并予灌胃猪油1 次，每次2 mL；每日用纱布包裹长尾夹夹住大鼠尾部，使其暴怒，每次30 min；强迫大鼠站立在2 cm 深的水中每日至少8 h。连续7 d。

2.2 观察指标

2.2.1 一般情况造模期间观察3 组大鼠一般情况，包括体质量、精神状态、动作行为、毛发光泽度、粪便性状等，并按 UC 活动指数（DAI）评分标准［11］进行评分，见表1。

表1 DAI 评分标准

2.2.2 病理学改变造模第8 天，各组大鼠禁食不禁饮 24 h，腹腔注射 20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉。打开腹腔，从肛门向上截取大鼠结肠组织，沿大鼠肠系膜缘纵向剪开，用生理盐水冲洗干净，平铺于滤纸上，肉眼观察结肠组织形态学改变，根据结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分标准［12］进行评分，见表2。选取约1 cm×1 cm 病变最明显处结肠组织，置于4%多聚甲醛固定后编号，酒精梯度脱水，二甲苯透化，常规石蜡包埋，切片厚度4 μm，苏木精-伊红染色（HE 染色），中性树胶封片后，光镜下观察结肠病理变化。

表2 CMDI 评分标准

2.3 模型评定

2.3.1 肝郁脾虚湿盛证模型评定标准根据文献［13-16］，主症：① 倦怠疲乏，懒动扎堆；② 精神萎靡，毛色光泽度下降、晦暗枯槁、稀疏易脱落；③ 便软或溏，肛周污秽，排便时肛门红肿，甚至脱肛；④ 行动缓慢，甚至斜行。兼症：① 体质量不增或增长缓慢，甚至降低；② 饮食量减少；③ 胃肠明显胀气。出现 3 项主症，或 2 项主症加 2 项兼症，即可认定肝郁脾虚湿盛证模型复制成功。

2.3.2 UC 模型评定标准根据文献［17-18］：①DAI 评分初步了解动物病症发展的严重程度；②肉眼观察结肠组织可见结肠充血水肿、肠壁增厚，严重者尚可见散落的溃疡点； ③ 病理学观察一般表现为大量淋巴、单核及中性白细胞等炎症细胞浸润，腺体呈现杯状细胞减少或消失，有隐窝脓肿和溃疡形成。

2.4 统计学处理运用SPSS 23.0 统计学软件进行结果分析，计量资料属正态分布的以表示，采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 3 组大鼠一般情况比较正常对照组大鼠精神状态良好，反应灵活，饮食量正常，皮毛光泽顺滑，粪便呈椭圆状。模型组造模第3 天出现饮食量减少，蜷缩扎堆，大便溏，肛门稍有污秽；第7 天出现精神萎靡，蜷卧懒动，嗜睡，抓取时暴躁易怒，体质量明显下降，大便偏稀带血，肛周污秽，与正常对照组比较，体质量显著下降（P＜0.01），DAI 评分显著升高（P＜0.01）。 DSS 组造模第 7 天出现懒动，蜷缩扎堆，饮食量减少，便稀，肛门污秽，与正常对照组比较，体质量下降，但不明显（P＞0.05），DAI 评分显著升高（P＜0.01）。见表3、表4。

表3 3 组大鼠造模后体质量比较g

注：与正常对照组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与 DSS 组比较，3） P＜0.01。

组别正常对照组DSS 组模型组n666 1 d 162.00±5.69 164.17±4.88 163.67±4.64 3 d 171.00±12.96 169.50±12.04 168.50±5.35 5 d 195.17±10.52 191.83±10.05 165.83±5.171）7 d 221.27±14.45 214.53±12.72 153.84±5.802）3）

表4 3 组大鼠造模后 DAI 评分分

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01；与 DSS 组比较，2） P＜0.01。

组别正常对照组DSS 组模型组n666 1 d 000 3 d 0 0.15±0.07 0.62±0.101）2）5 d 0 0.47±0.061）1.38±0.151）2）7 d 0 0.55±0.101）1.72±0.081）2）

3.2 3 组大鼠结肠黏膜改变及病理观察比较正常对照组结肠纹理清晰结构完整，无损伤，腺体排列整齐，间质未见水肿、充血、溃疡。模型组结肠黏膜明显充血、水肿，肉眼可见溃疡点，与正常对照组比较，CMDI 评分显著升高（P＜0.01），黏膜层溃烂严重，腺体结构完全破坏，杯状细胞消失，大量炎症细胞浸润，间质水肿、充血明显且有炎症细胞浸润。DSS 组结肠黏膜表面可见充血、水肿，偶可见针尖样溃疡，与正常对照组比较，CMDI 评分显著升高（P＜0.01），腺体排列紊乱，结构破坏，杯状细胞消失，间质充血、水肿，大量炎症细胞浸润。见表5、图1。

4 讨论

图1 光学显微镜下3 组大鼠结肠组织HE 染色图（×20）

表5 3 组大鼠造模后 CMDI 评分分

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01；与 DSS 组比较，2） P＜0.01。

组别正常对照组DSS 组模型组n666 CMDI 评分0 1.07±0.191）1.68±0.201）2）

中医学认为UC 的发病与脾胃功能虚弱密切相关，因饮食不节或进食生冷，损伤脾气，或者情志失调，肝气乘脾，脾胃运化失职，食积湿胜而致泄泻。本病以脾虚失健为主要发病基础，缓解期主要以脾虚为本。本病病机与“湿”密不可分，若湿与热结于大肠，大肠传化失司而致泄泻，急则暴下如注，缓则时止时泻。DSS 法是制备UC 的常用方法之一，其致炎机制可能与细胞功能失调、肠道菌群失调有关［19］，通常采用自由饮用一定浓度的DSS 溶液制备急性UC 模型。制备中医证型的UC 模型常在此基础上施加环境、饮食、情绪等因素干扰，使模型出现与中医证候相类似的症状。

本实验拟建立肝郁脾虚湿盛型UC 模型，控制DSS 诱导次数，使模型产生急性期与缓解期交替出现的症状，更符合人类UC 发病周期规律，且有研究［20］发现 DSS 溶液定量灌胃诱导的 UC 模型在溃疡出现的时间、程度、位置比自由饮用相比均一性高。本实验结果表明：单纯采用DSS 定量灌胃，模型虽在有结肠组织病理学改变，但在饮食量、皮毛光泽度等一般情况未见明显变化，缺乏中医证候特点；采用DSS 定量灌胃结合内外因素干预的方法，模型既表现出倦怠懒动，饮食量减少，拱背，毛色光泽度降低等体征，结肠黏膜改变也符合组织病理学特点，故本研究选择DSS 溶液定量灌胃结合内外因素干预的方法诱导UC 模型。

DAI 评分表是较公认地、能较准确地早期诊断UC［21］，本实验中模型组与正常对照组比较，DAI、CMDI 评分均显著升高，在造模后也出现类似肝郁脾虚湿盛的症状，结肠组织病理学也支持造模成功结论，以上实验结果初步显示：肝郁脾虚湿盛证之UC 大鼠模型基本成功。本实验后期将对此造模法再做深入研究，试采用DSS 溶液定量灌胃重复诱导的方法，探究该模型的稳定性，以建立较理想、稳定、更符合实验课题的肝郁脾虚湿盛证UC 大鼠模型。