过表达NEDD9对miR-193a-3p抑制结肠癌细胞SW480侵袭转移的影响

黄裕文 高 昆 任显坤

结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率逐年上升，严重威胁人类健康。但其发生发展机制尚未完全清楚。有研究报道结直肠癌患者根治术前血清miR-193a-3p水平降低，并与癌组织分化程度、临床分期、淋巴结转移等病理特征密切相关[1]，研究发现神经前体细胞表达下调蛋白9(Neural Precursor Cell Expressed Developmentally Down-regulated 9，NEDD9) 在结肠癌组织中高表达，并与癌组织分化程度、浸润程度、淋巴结转移以及临床分期显著相关[2]。上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)也在癌细胞的侵袭和转移中起重要作用[3]。而过表达miR-193a-3p可抑制结肠癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡[4]。但NEDD9表达水平对miR-193a-3p的影响及对EMT的作用少见报道。本实验初步观察转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭能力变化及过表达NEDD9对miR-193a-3p和EMT作用的影响。

1 材料与方法

1.1实验用细胞及主要试剂和器材

人结肠癌细胞SW480(编号：ATCC-0295)购自美国菌种保藏中心；胎牛血清(批号：KSJ30472)、DMEM培养基(批号：AAE202588)、胰蛋白酶(批号：X4380)购自美国Gibico公司；细胞总RNA提取试剂(批号：RE0101T)、反转录试剂盒(批号：RR047A)、荧光定量试剂盒(批号：WD3122)购自日本TaKaRa公司；二甲基亚砜(DMSO，批号：RNBF2134)、RIPA蛋白裂解液(批号：180503)、二辛可宁酸(Bicinchoninic acid，BCA)试剂盒(批号：182754)购自美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒(批号：GHS02)购自日本同仁；Matrigel胶(批号：354234)购于美国BD公司；LipofectamineTM2000转染试剂(批号：371954)购自美国Invitrogen公司。miR-con、miR-193a-3p、si-con、si-NEDD9、pcDNA、pcDNA-NEDD9质粒购自武汉维诺赛生物技术有限公司；4%多聚甲醛(批号：90090525)、0.1%结晶紫(批号：20180529)购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室(批号：23217004)购于美国BD公司；Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；CKX41-F32FL荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1结肠癌细胞SW480处理与分组：将人结肠癌细胞SW480用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃恒温培养箱中培养，每天换液一次，待细胞融合至90%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代。

取对数生长期SW480细胞，将miR-con、miR-193a-3p、anti-miR-con、anti-miR-193a-3p、si-con、si-NEDD9分别转染至SW480细胞，记为miR-con组、miR-193a-3p组、anti-miR-con组、anti-miR-193a-3p组、si-con组、si-NEDD9组；正常培养不行转染SW480细胞作为对照组(NC组)；将miR-193a-3p分别与pcDNA、pcDNA-NEDD9共转染SW480细胞，记为miR-193a-3p+pcDNA组、miR-193a-3p+pcDNA-NEDD9组。每组9例。转染采用脂质体法，转染时先用不含血清培养基稀释质粒和LipofectamineTM2000试剂，终量100μl，两者轻轻混合，室温静置10min后加入含SW480细胞培养液，37℃培养6h，换新鲜培养液继续培养48h。

1.2.2蛋白质印迹法(Western Blot)检测SW480细胞NEDD9、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞核增殖抗原标记物(Ki67)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平：取各组细胞，用胰蛋白酶消化后，加入培养液重悬，制成1×105个/ml细胞悬液，将其接种至6孔板中，培养48h后用提取试剂盒提取总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，其浓度为265.34μg/ml；纯度为89.73%。将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1h，再分别加入NEDD9、Cyclin D1、Ki67、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，Tris盐吐温缓冲液(TBST)洗膜；加入山羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶2 000)室温孵育90min，TBST洗涤，用ECL发光液显影，用ChemiDoc XRS+系统(美国BD公司)成像，用Quantity One凝胶分析软件(美国BD公司)测定各组蛋白条带的灰度值，用电泳条带灰度比值(目的条带灰度值/内参条带灰度值)表示有关蛋白表达量，灰度比值与蛋白表达量呈正比。每个蛋白样品设3个重复。

1.2.3MTT检测细胞存活率：取各组细胞，用胰蛋白酶消化后，重悬制成1×105个/ml细胞悬液，接种6孔板，培养48h，加入MTT溶液20μl，37℃孵育4h；弃去培养液，每孔加入150μl DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解后，用酶标仪在490nm波长检测各孔吸光度(OD)。细胞存活率(%)=各实验组OD值/NC组OD值×100%。实验重复3次，每次设3个复孔。

1.2.4Transwell检测细胞迁移和侵袭：取各组细胞，用胰蛋白酶消化后，加入培养液重悬，制成1×104个/ml细胞悬液。(1)细胞迁移实验：分别将600μl DMEM完全培养液和200μl各组SW480细胞悬液加入Transwell小室的下室和上室，放入细胞培养箱中培养24h。取出小室，吸去培养液后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定30min，再用0.1%结晶紫染色10min，显微镜观察拍照，计数结晶紫染色细胞(即迁移细胞)数。(2)细胞侵袭实验:将60μl Matrigel加入300μl无血清DMEM培养液中混匀，然后取其铺满Transwell小室的上室，取各组SW480细胞悬液，同细胞迁移实验相同操作，最后计数侵袭细胞。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480存活率、迁移侵袭数量和相关蛋白表达

方差分析显示，各组SW480细胞存活率、迁移和侵袭数量及相关蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.01)。miR-con组与NC组相比，各指标水平差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-193a-3p组与miR-con组相比，结肠癌细胞SW480存活率显著降低(t=9.67，P<0.01)，细胞迁移和侵袭数量均显著减少(t=17.43、15.91均P<0.01)；Cyclin D1、Ki-67、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低(t=13.04、13.67、12.96、23.43，均P<0.01)。见图1，表1。

图1 转染miR-193a-3p结肠细胞SW480的Cyclin D1、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白电泳图(W-B)

表1 转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480存活率、迁移、侵袭数量及相关蛋白表达水平比较均=9)

2.2沉默NEDD9结肠癌细胞SW480存活率、迁移侵袭数量和相关蛋白表达

方差分析显示，各组SW480细胞NEDD9表达水平、存活率、迁移侵袭数量和相关蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.01)。si-con组与NC组相比，各指标水平差异均无统计学意义(P>0.05)。si-NEDD9组与si-con组相比，结肠癌细胞SW480中NEDD9表达水平显著降低(t=20.88，P<0.01)，细胞存活率(t=9.14，P<0.01)显著降低，细胞迁移数量(t=12.90)和侵袭数量(t=13.78)显著减少(均P<0.01)。Cyclin D1、Ki-67、MMP-2、MMP-9表达水平(t=17.06、17.89、14.65、12.41，均P<0.01)。见表2，图2。

表2 沉默NEDD9结肠癌细胞SW480存活率、迁移侵袭数量及相关蛋白表达水平比较均=9)

图2 沉默NEDD9结肠癌细胞SW480的NEDD9、Cyclin D1、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白电泳图(W-B)

2.3过表达NEDD9对转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480存活率、迁移侵袭数量和相关蛋白抑制作用

与miR-193a-3p+pcDNA组相比，miR-193a-3p+pcDNA-NEDD9组结肠癌细胞SW480中NEDD9表达水平显著升高(P<0.01)，同时，蛋白水平Cyclin D1、Ki-67、MMP-2、MMP-9(t=8.49,14.76,6.24,4.63，均P<0.01)显著升高，细胞存活率(t=6.80)、细胞迁移(t=11.75)和侵袭数量(t=8.30)显著增加(均P<0.01)。见图3，表3。

图3 过表达NEDD9对转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480表达NEDD9、Cyclin D1、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白电泳图(W-B)

表3 过表达NEDD9对转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480存活率、迁移侵袭数量和相关蛋白的作用均=9)

2.4过表达NEDD9对转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480中EMT指标的调控作用

方差分析显示，各组SW480中EMT指标差异均有统计学意义(P<0.01)。miR-193a-3p组与miR-con组相比，结肠癌细胞SW480中E-cadherin表达水平显著升高(t=14.14，P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表达水平显著降低(t=14.31、13.08，均P<0.01)；miR-193a-3p+pcDNA-NEDD9组与miR-193a-3p+pcDNA组相比，结肠癌细胞SW480中E-cadherin表达水平显著降低(t=10.40，P<0.01)N-cadherin、Vimentin表达水平显著升高(t=4.84、8.94，均P<0.01)。见图4，表4。

图4 过表达NEDD9对转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达电泳图(W-B)

表4 过表达NEDD9对转染miR-193a-3p结肠癌细胞SW480中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的作用均=9)

3 讨 论

结直肠癌是一种恶性肿瘤，多数患者发现时已是晚期，且多发生转移。有研究发现miR-193a-3p通过靶向纤溶酶原激活剂尿激酶(Plasminogen Activator Urokinase，PLAU)可抑制结直肠癌细胞的生长、迁移和血管生成[5]。本实验结果显示转染miR-193a-3p，结肠癌细胞SW480中Cyclin D1、Ki-67、MMP-2、MMP-9表达水平显著下调，细胞存活率显著降低，细胞迁移和侵袭数量明显减少。进一步说明过表达miR-193a-3p可抑制结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭。其机制是否与上述PLAU关联尚需求证。

NEDD9可参与细胞增殖、迁移、侵袭和EMT等。已有报道敲低NEDD9能够抑制结肠癌细胞SW480迁移、侵袭和转移[6]。该结果通过本实验沉默处理NEDD9得以验证。而过表达NEDD9可促进结直肠癌细胞HCT116的侵袭和迁移[7,8]，本实验通过过表达NEDD9，除上述作用外，还可逆转miR-193a-3p抑制结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭效能，这可能由于NEDD9与miR-193a-3p存在结合位点，可能靶向调整miR-193a-3p，从而发挥逆转作用有关。

EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的过程，是促使细胞转移和侵袭的关键因素[9]。N-cadherin、E-cadherin和Vimentin是EMT相关分子标志物，结直肠癌组织中E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调可促进结直肠癌的侵袭转移[10]。本实验结果显示，转染miR-193a-3p的结肠癌细胞SW480，其E-cadherin表达水平显著升高，N-cadherin、Vimentin表达水平显著降低；表明上调miR-193a-3p可能抑制EMT进展；而过表达NEDD9逆转了miR-193a-3p对N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表达的调控作用。

综上所述，上调miR-193a-3p表达可抑制结肠癌细胞SW480的增殖、迁移和侵袭，过表达NEDD9可逆转miR-193a-3p对SW480增殖、迁移、侵袭和EMT指标的抑制作用。可为结肠癌的临床诊疗研究提供参考。◀