导管留置大鼠局部血栓形成及一氧化氮和组织因子血清水平变化*

韦 艳 应燕萍，# 凌 瑛 赵慧函 蒋庆娟 甘 晓 文 萃

中心静脉血管通路装置(Central Venous Access Device, CVAD)已经广泛应用于重症监护病房和慢性疾病人群，尤其是肿瘤患者[1]。其所诱发的导管相关性血栓(Catheter-Related Thrombosis, CRT)[2，3]，除造成导管失用，延长患者住院时间，增加诊疗费用外，严重者可引起肺栓塞。因此，研究CRT的形成过程及影响因子，对科学预防CRT有重要意义。本文观察分析颈外静脉置管大鼠局部血栓形成情况，并同步检测血清一氧化氮(NO)和组织因子(TF)水平变化及其与血栓形成的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物和分组处理

清洁级SD大鼠120只，雄性，3月龄，体重160-210g，由广西医科大学实验动物中心提供和饲养(实验动物生产许可证号：SYXK桂2014-0002)室温20-25℃，湿度50%-60%，光线、通风良好。适应性饲养1周后，按照随机数字表法将其均分为空白组、手术组、置管组。置管组参照王晓英等[4]置管手术方法并进行适当改良，即以1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧位固定于操作台，备皮、消毒，沿颈中线偏右侧0.5cm作一纵行切口(长约2cm)，依层切开皮肤、皮下组织，钝性分离暴露右颈外静脉，游离血管约1-1.5cm，用眼科剪在静脉管壁上全层剪一“V”形小口(约占静脉周长的1/3-1/2)，将末端连接有1ml注射器的小鼠颈静脉硅胶导管(1#)插入其中2-2.5cm，抽吸注射器见血液回流即予生理盐水冲管，不锈钢堵头封管；以4-0号线结扎并缝合固定导管和切口。手术组不行静脉切开，仅暴露右颈外静脉。空白组不作任何手术处理。手术大鼠术后立即0.5%碘伏消毒手术切口，电暖器保温，待麻醉清醒后分笼饲养。所有大鼠的使用和实验后处置均经过广西医科大学动物实验和伦理委员会批准。

1.2主要实验器材和试剂

小鼠颈静脉(硅胶)导管及配套不锈钢堵头购自思科诺生物科技(北京)有限公司；酶标仪(Multiskan Fc)购自美国Thermo公司；紫外可见分光光度计(UV-5200PC型)购自上海元析仪器公司；生物组织自动包埋机(HD-310型)购自湖北慧达仪器有限公司；组织切片机(RM2245型)购自德国Leica公司；正置荧光显微镜(BX53型)购自日本Olympus公司 ；大鼠血清NO试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号：20190319/20190327)；大鼠血清TF测定的ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，批号：CSB-E07914r)。

1.3实验样本采集和相关检测方法

1.3.1血样和组织样本采集：术后第1天、4天、7天、10天、14天，分别从三组大鼠中随机取8只，如前麻醉后，仰卧固定于操作台上，于腹部作一长约3cm纵行切口，将肠管移出腹腔并用生理盐水纱布进行保护，暴露腹主动脉，用一次性采血针行腹主动脉采血，每只大鼠抽血5ml，4 000 r/min离心5min，取上层血清置于EP管内，-80℃深低温冰箱保存，还原肠管、关腹。大鼠处死后，各组自右颈外静脉至上腔静脉段切取长约2cm的血管，用10%福尔马林固定48h。

1.3.2组织病理检查和血清NO、TF浓度测定：从固定液中取出血管切成3mm×10mm组织块，按常规方法脱水后石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察血栓形成情况。血清NO浓度采用硝酸还原酶法测定，按试剂盒说明书操作，通过比色测定吸光度值计算NO含量。血清TF浓度采用ELISA测定，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4统计学处理

2 结 果

2.1置管组大鼠血栓形成情况

病理结果显示，空白组及手术组大鼠颈外静脉 内膜完整，管腔内均无血栓形成。置管组有34只大鼠发现血栓，发生率为85%(34/40)，术后第1天、4天、7天、10天、14天分别为10.00% (4/40)、15.00% (6/40)、20.00% (8/40)、20.00%(8/40)、20.00%(8/40)。术后第1天、4天均为混合血栓，镜下可见血小板小梁及梁间红细胞分布，术后第4天的血栓体积及血管壁炎症浸润程度较术后第1天严重。术后第7天、10天、14天分别有3例、6例、7例发生血栓机化，且血栓机化程度随时间增加逐渐加重，并有2例出现血管再通。术后第7天血栓与血管壁开始形成黏连，血管壁周围可见中性粒细胞为主的炎细胞浸润；术后第10天，血栓与血管壁的黏连面积、血管壁炎细胞浸润程度、纤维增生以及毛细血管生成等均较术后第7天明显增加，且肉芽组织由开始机化时的管壁黏连处局部生长向血栓内部蔓延式生长；术后第14天，新生肉芽组织完全替代血栓，即完全机化，血栓中央区崩裂，周围新生的血管内皮细胞向裂隙表面迁移覆盖，形成了新的血管。见图1。

2.2各组大鼠血清NO、TF水平比较(表1、表2)

表1 三组大鼠术后不同时间点血清NO水平比较均=40)

表2 三组大鼠术后不同时间点血清TF水平比较均=40)

空白组及手术组大鼠NO、TF的血清浓度在不同时间点的差异无统计学意义(P>0.05)。置管组大鼠术后不同时间点血清NO、TF水平差异有统计学意义(P<0.01)；血清NO水平在术后第1天-10天逐渐降低，第10天降至最低，第14天有所升高；血清TF水平在术后第1天-10天逐渐增加，第10天达到峰值，第14天急剧下降。

术后各时间点血清NO和TF水平在空白组和手术组组间差异无统计学意义(P>0.05)。置管组术后各时间点NO水平较空白组显著降低，t值分别为-4.701、-5.505、-10.250、-24.259、-24.983(均P<0.01)；置管组术后第1天、4天、7天的血清NO水平与手术组无显著差异(P>0.05)，第10天、14天NO水平较手术组明显降低，t值分别为-6.627、-7.727(均P<0.01)。术后各时间点，置管组TF水平较空白组显著升高，t值分别为2.897、7.210、7.073、9.340、4.258(均P<0.01)，置管组术后第1天、4天、7天、10天的TF水平较手术组明显升高，t值分别为2.307、5.526、5.073、9.096(均P<0.01)，第14天TF水平与手术组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3相关性分析

相关分析显示，置管组大鼠术后第1-14天血清NO水平变化与其血栓形成率呈负相关(r=-0.607，P<0.01)，术后第1-10天血清TF水平与其血栓形成率呈正相关(r=0.438，P<0.01)。

3 讨 论

置管操作和导管留置对血管壁的机械刺激及局部血流变缓，共同诱发血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell，VEC)损伤，除有利于血小板黏附、聚集和活化，其自身会释放组织因子，激活凝血因子Ⅶ等启动，内、外源性凝血途径；可能形成CRT；而局部血流变缓可致血管内膜缺血缺氧，VEC变性，内皮下胶原暴露，亦能触发凝血过程，加上炎症的影响，都能助力CRT形成。本文结果表明随置管时间的延长CRT形成从混合血栓直至完全机化，渐进过程分明，置管第7-14天CRT机化程度与时间平行，逐渐加重。该CRT时效结果为开展中心静脉置管临床研究提供了借鉴和参考。

NO具有舒张血管、抑制血小板黏附聚集及血栓形成等作用,是保护血管壁的重要生物活性物质[5，6]。Brisbois等[7]报道，在兔颈外静脉置入内壁含NO释放涂层的中心静脉导管(CVC)组，9天后发现CRT面积减少为普通CVC组的7倍。还有研究[8]，给予骨折术后患者外源性NO吸入(观察组)，其血栓发生率明显低于非吸入对照组。我们的研究结果显示，置管1-14天患者NO水平较空白组显著降低，置管10-14天患者也较手术组明显降低，结合上述CRT进程，提示置管操作和导管留置引起的VEC损伤使其合成分泌NO减少，是引起CRT原因和机制之一。所幸术后第14天，由于新的微血管生成，内皮功能逐步恢复NO水平有所升高。这一变化对改善CRT可能有积极意义。

TF是生理性凝血级联反应的主要启动因子，血管内皮损伤时，可大量释放入血，启动凝血过程，促使血栓形成。宋恩等[9]在进行深静脉血栓(DVT)动物成模术后2h开始，TF血液水平逐渐增加。吴延平等[10]在临床行全膝关节置换时发现术后血栓形成患者TF水平升高。本文结果中，置管第1天-10天患者TF水平较手术组及空白组明显升高，第10天达到峰值，而到置管第14天，TF水平明显下降。此等变化与NO正好相反，从而构成与CRT与NO相互促进和制约机制，两者与CRT分别表现为正相关和负相关关系，因而提示维持和调整TF和NO在合适水平和比例，对防治CRT或可起到重要作用。

综上所述，置管手术和导管置留可致大鼠CRT形成，NO水平下降和TF水平升高是CRT形成的重要影响因子，靶向NO/TF对防治CRT有益。◀